白細(xì)胞介素21受體(IL-21R)信號(hào)在TNBS誘導(dǎo)小鼠炎癥性腸病病變形成中的作用研究.pdf

1、目的:炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種特殊的慢性炎癥性腸道疾病，包括克羅恩氏病(Crohn's disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)，其病因和發(fā)病機(jī)制與遺傳基因、環(huán)境、生活習(xí)慣和免疫系統(tǒng)功能紊亂等多種因素密切相關(guān)。但目前，普遍認(rèn)為腸黏膜異常的免疫應(yīng)答是引起黏膜組織損傷及慢性炎癥的重要原因。IL-21作為γ鏈細(xì)胞因子家族成員之一，與其受體結(jié)合后發(fā)

2、揮多種生物學(xué)調(diào)節(jié)功能，參與包括IBD在內(nèi)的多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。據(jù)調(diào)查，臨床IBD患者血清中IL-21水平明顯增加，提示IL-21/IL-21R信號(hào)可能在IBD的病變形成中發(fā)揮重要作用，但在以DSS或TNBS等化學(xué)試劑誘導(dǎo)的小鼠IBD模型中，IL-21/IL-21R信號(hào)對(duì)IBD發(fā)生發(fā)展的具體作用機(jī)制尚不十分明確。因此，本課題利用IL-21R基因敲除小鼠建立TNBS誘導(dǎo)的炎癥性腸病動(dòng)物模型，探討IL-21/IL-21R信號(hào)在炎癥性

3、腸病病變形成中對(duì)腸固有層輔助T細(xì)胞應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制，及對(duì)炎癥性腸病發(fā)生、發(fā)展的影響。
　　研究方法:利用C57BL/6J(wild type，WT)和相同基因背景的IL-21R基因敲除小鼠（IL-21RKO），建立TNBS誘導(dǎo)的炎癥性腸病動(dòng)物模型（因TNBS誘導(dǎo)的腸炎模型癥狀與人類(lèi)IBD，尤其是CD的臨床癥狀和病理表現(xiàn)相似，且模型建立方法成熟）:兩組小鼠均禁食12h后，用4％TNBS灌腸，每組15只。
　　(1)參照Coope

4、r HS的方法，每天稱(chēng)量各組小鼠體重，觀察其糞便性狀、下痢、大便隱血狀況及生存率。
　　(2)小鼠誘導(dǎo)第五天，取近心端1/2處結(jié)腸組織0.5 cm，浸泡于4％多聚甲醛溶液中固定，隨后經(jīng)過(guò)脫水、石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及炎癥反應(yīng)情況，根據(jù)Sun等的炎癥分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估病理組織學(xué)得分。
　　(3)小鼠誘導(dǎo)第五天，分離和提取腸固有層淋巴細(xì)胞(lamina propria lymphocyte，L

5、PL)，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，體外PMA/ionomycin/BFA刺激下再培養(yǎng)4h，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞比例和絕對(duì)數(shù)。
　　(4)將2×105 LPL置于96孔板中，在有、無(wú)TCR刺激條件下（刺激組:加入抗CD3抗體10μg/ml和抗CD28抗體1μg/ml;非刺激組:不加抗體）體外培養(yǎng)48小時(shí)后取各孔細(xì)胞培養(yǎng)上清，應(yīng)用ELISA試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)檢測(cè)培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子的分泌（IFN-γ、 IL-4、

6、IL-17A、IL-10）。
　　結(jié)果:1、TNBS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性腸炎模型成功建立。2、與WT小鼠相比，IL-21RKO小鼠肉眼可見(jiàn)腸管明顯縮短、水腫、充血，腸管易脆;組織病理學(xué)檢測(cè)上皮損傷嚴(yán)重、隱窩大面積消失、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并侵犯到黏膜肌層，黏膜下層組織水腫增厚，組織學(xué)評(píng)分明顯增加;與WT小鼠相比，IL-21RKO小鼠體重下降更快，生存率明顯降低，對(duì)TNBS誘導(dǎo)的腸炎易感性顯著增強(qiáng)。3、與WT小鼠相比，IL-21RKO小鼠