黑曲霉基因阻斷突變菌株的構(gòu)建及其功能分析.pdf

1、西南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文黑曲霉基因阻斷突變菌株的構(gòu)建及其功能分析姓名：趙春田申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：彭遠(yuǎn)義唐國(guó)敏20050501西南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘璺因(助h)在絲狀真菌中的表達(dá)單元構(gòu)建成以pBS為載體的pepAd基因阻斷重組質(zhì)粒pBSAdH，并通過(guò)原生質(zhì)體PEG／CaCl2法將HpaI酶切得到的線性同源片段轉(zhuǎn)化到AnigerGICC2773菌株中通過(guò)潮霉素抗性平板篩選到89個(gè)潮霉索抗性轉(zhuǎn)化子，采用PCR方法從抗

2、性轉(zhuǎn)化子中篩選到1個(gè)pepD基因阻斷突變菌株ApepAdl9。外源蛋自漆酶分泌活性分析顯示pepAd基因的阻斷對(duì)漆酶的表達(dá)分泌沒(méi)有顯著的影響。3以AspergittusnigerGICC2773基因組DNA為模板，用PCR方法分別擴(kuò)增den基因中的上游83lbp和下游998bp兩段DNA序列，將此兩段序列按同一方向分別插入質(zhì)粒pMWI中潮霉素抗性基因(hph)表達(dá)單元的5’和3’端。構(gòu)建成derl基因阻斷重組質(zhì)粒pMWderlH。然后采

3、用原生質(zhì)體PEG／CaCl2法，將酶切pMWderlH得到的derl基因阻斷線性片段轉(zhuǎn)化AnigerGICC2773菌株，通過(guò)潮霉紊選擇平板得到45個(gè)潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子，然后采用PCR方法從這些抗性轉(zhuǎn)化子中篩選到1個(gè)由于同源重組產(chǎn)生的derl基因阻斷突變菌株△derI2。外源基因漆酶表達(dá)分泌活性分析顯示該突變株的外源蛋白酶漆酶分泌活性明顯下降。然后以AspergillusnigerGICC2773基因組DNA為摸板，用PCR方法擴(kuò)增der

4、l基因809bp片斷，構(gòu)建成由構(gòu)巢曲霉甘油醛一3一磷酸脫氫酶啟動(dòng)子(PpgpdA)和色氨酸終止予(TtrpC)引導(dǎo)表達(dá)、以amdS為選擇標(biāo)記的derl重組表達(dá)質(zhì)粒pVADS。采用原生質(zhì)體PEG／CaCl2法以pVADS轉(zhuǎn)化derl基因阻斷突變菌株Aderl2，將derI基因重薪整合到其染色體上，獲德derl基因恢復(fù)菌株。外源蛋白漆酶分泌活性分析顯示漆酶話性又恢復(fù)到原出發(fā)菌株AspergillusnigerGICC2773的水平，說(shuō)明de