黑曲霉PgxB基因缺失菌株的構(gòu)建及特性研究.pdf

1、黑曲霉是一種廣泛存在于自然界的絲狀真菌，分布于土壤、空氣和谷物上，能夠引起食物、谷物和果蔬的霉腐變質(zhì)，尤其是多汁類果實(shí)，如蘋果、梨、桃子、石榴等的典型采后儲(chǔ)藏侵染菌。植物細(xì)胞壁中的主要成分-果膠主要是由不同酯化程度的半乳糖醛酸以α-1，4-糖苷鍵連接形成的多糖鏈，而果膠酶是植物病原菌突破植物細(xì)胞壁的主要細(xì)胞壁降解酶類，其中多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)是主要的成員。作為工業(yè)發(fā)酵微生物，黑曲霉也用于生產(chǎn)果膠酶

2、，應(yīng)用在食品加工行業(yè)。已有研究表明，對(duì)于某些真菌和植物，PG是真菌的致病因子，但在黑曲霉中尚無(wú)果膠酶基因的相關(guān)報(bào)道，因此我們研究黑曲霉外切多聚半乳糖醛酸酶基因pgxB在致病性中的作用，這對(duì)于黑曲霉果膠酶基因功能研究以及采后果蔬的儲(chǔ)藏有重要意義。
　　研究基因功能最直接的方法就是敲除此基因。我們以黑曲霉(Aspergillusniger MA70.15(ΔkusA，pyrG-)）為材料，利用同源重組的敲除原理，以pyrG作為篩選標(biāo)記

3、基因(pyrG編碼蛋白乳清酸核苷-5'-磷酸脫氫酶，pyrG缺陷型菌株不能在不含尿苷的條件下生長(zhǎng)，但能抵抗5-氟乳清酸的毒性)敲除pgxB基因。首先我們從曲霉基因庫(kù)獲取黑曲霉pgxB基因序列，擴(kuò)增出pgxB上下游側(cè)翼片段AB(548bp)和CD(564bp)，將兩者連接后再與質(zhì)粒pC3(5865bp，含有pyrG)連接，形成pC3-ABCD(6959bp)敲除載體;接下來(lái)用PEG轉(zhuǎn)化法將敲除載體轉(zhuǎn)化黑曲霉原生質(zhì)體，利用pyrG進(jìn)行雙向篩

4、選，經(jīng)鑒定得到黑曲霉pgxB基因缺失菌株。我們發(fā)現(xiàn)ΔpgxB所產(chǎn)的果膠酶活性比野生型低5.8％，pgxB的缺失顯著降低了黑曲霉對(duì)采后蘋果和梨果實(shí)的致病性(P＜0.01)，其侵染所致的菌斑直徑相對(duì)于野生型減少了20％。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明在侵染采后蘋果過(guò)程中，pgxB的缺失導(dǎo)致相同功能的其它多聚半乳糖醛酸酶基因(pgaⅠ, pgaⅡ, pgaA，pgaC，pgaD，pgaE)表達(dá)量升高，可能原因?yàn)檠a(bǔ)償pgxB功能的缺失，但pgxB缺失型菌株的致

5、病性仍然顯著減弱。以上結(jié)果表明pgxB是黑曲霉的重要致病因子，在采后蘋果、梨果實(shí)的儲(chǔ)藏過(guò)程中發(fā)揮作用。
　　進(jìn)一步研究表明，pgxB的缺失未能影響黑曲霉在PDA和果膠培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)。我們還發(fā)現(xiàn)黑曲霉野生型與ΔpgxB對(duì)重金屬離子鋁、鋅、鎘、銅的敏感性無(wú)顯著差異，具體表現(xiàn)在菌落直徑和生長(zhǎng)量方面，說(shuō)明多聚半乳糖醛酸酶基因pgxB與黑曲霉對(duì)重金屬脅迫的敏感性沒(méi)有關(guān)聯(lián)性。然而，重金屬脅迫能夠抑制黑曲霉產(chǎn)果膠酶。對(duì)果膠酶生產(chǎn)外源影響因子