高劑量esiRNA引起adar-1基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)的初步研究.pdf

1、RNA干擾(RNAi)是廣泛存在于各種生物中，在進化上非常保守的一種轉(zhuǎn)錄后基因表達沉默的機制。隨著RNA干擾技術(shù)的不斷發(fā)展，大量的研究小組將RNA干擾作為高效實用的工具來對基因功能、信號傳導通路以及疾病的發(fā)生機制進行研究。但是對于RNA干擾的調(diào)節(jié)機制卻研究的很少，雖然有一些可以調(diào)控RNA干擾信號的蛋白質(zhì)已經(jīng)被鑒定并進行了功能的探討。本實驗室前人的工作已經(jīng)證明：當高劑量的esiRNA進入實驗動物體內(nèi)或細胞內(nèi)時，會引起RNA特異性的脫氨酶基

2、因adar-1的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，導致高劑量esiRNA干擾的效果不佳。而如果同時引入adar-1和eri-1基因esiRNA，則可以改善沉默靶基因的效果。這些現(xiàn)象引起對于adar-1基因啟動子區(qū)域的關(guān)注。因此，后續(xù)的研究對adar-1基因啟動子對于高劑量esiRNA誘導的響應(yīng)進行了初步的探索。
　　 在這部分工作中，以增強型綠色熒光蛋白(EGFP)和分泌型堿性磷酸酶(SEAP)為報告基因，構(gòu)建了帶有不同長度adar-1基因啟動子區(qū)

3、域的質(zhì)粒，并將這些質(zhì)粒和非特異性esiRNA共轉(zhuǎn)染到轉(zhuǎn)染CHO細胞中。通過觀察細胞內(nèi)綠色熒光的強度以確定能夠響應(yīng)高劑量esiRNA誘導的最小區(qū)段。實驗結(jié)果顯示：adar-1基因啟動子能夠響應(yīng)高劑量esiRNA誘導的最小區(qū)段位于起始密碼子ATG上游200bp以內(nèi)。為了進一步確定響應(yīng)誘導的啟動子元件，對此200bp的序列進行了生物信息學的檢索，將得分最高的PU.1啟動子結(jié)合位點確定為響應(yīng)高劑量esiRNA誘導的候選元件。既而，采用缺失突變的

4、方法對該轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點在esiRNA誘導adar-1基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)中的作用進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PU.1啟動子結(jié)合位點缺失后，adax-1基因啟動子無法響應(yīng)esiRNA的劑量誘導，綠色熒光及培養(yǎng)基中分泌型堿性磷酸酶含量較對照組不再有差別；而當把該元件插入adar-1基因起始ATG上游180bp前端后，adaz-1啟動子又恢復其對于高劑量esiRNA的響應(yīng)。因此說明，高劑量esiRNA引起adar-1轉(zhuǎn)錄上調(diào)主要是通過其啟動子的PU.1元件發(fā)

5、揮作用的。為了證明轉(zhuǎn)錄因子PU.1在高劑量esiRNA引起adar-1轉(zhuǎn)錄上調(diào)中所其的作用，又將特異性的PU.1 esiRNA轉(zhuǎn)染到CHO細胞中以沉默內(nèi)源性PU.1基因，然后觀察esiRNA上調(diào)報告基因轉(zhuǎn)錄的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當內(nèi)源性PU.1被knock down后，高劑量的esiRNA進入細胞后，不再能誘導adar-1轉(zhuǎn)錄上調(diào)，實驗組較對照組熒光強度及培養(yǎng)基中分泌型堿性磷酸酶含量無明顯加強。而當使用過量表達轉(zhuǎn)錄因子PU.1蛋白的方法模擬