早期反應(yīng)基因Egr-1參與高糖誘導(dǎo)β細胞凋亡的初步研究.pdf

1、目的:糖尿病是一種慢性代謝性疾病，是由于胰島素絕對或相對缺乏而引起的。在臨床上患者被診斷為Ⅰ型糖尿病或Ⅱ型糖尿病時，病人的胰島β細胞均已達到50％-80％的減少。作為機體中唯一可以分泌降血糖激素即胰島素的細胞群，胰島β細胞功能的損傷或數(shù)量的減少都會導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。有研究表明，糖尿病人的胰島β細胞的凋亡是由于長期處在高血糖狀態(tài)，即是由“糖毒性”所誘發(fā)的。
　　 Egr-1是被認為和肥胖及糖尿病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。Egr-1同時也是一

2、種早期應(yīng)激蛋白，可以被很多細胞因子、生長因子快速的激活。有研究報道，Egr-1可能通過調(diào)控下游基因多方面地參與到Ⅱ型糖尿病的病理發(fā)生過程中。實驗室前期也證明了Egr-1與Ⅱ型糖尿病發(fā)展過程中的部分胰島素抵抗的發(fā)生有關(guān)。然而，Egr-1在糖尿病中的胰島β細胞凋亡的作用方面還未見研究報道。因此在本項研究中，擬比較在正常濃度葡萄糖以及高濃度葡萄糖的長期誘導(dǎo)條件下，Egr-1基因在胰島β細胞中表達的水平與β細胞凋亡的程度關(guān)系，并探討該基因表達對

3、高糖誘導(dǎo)的β細胞功能衰竭的影響和相關(guān)的機制，為臨床Ⅱ型糖尿病的防治提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 本實驗中，使用了永生化的非肥胖糖尿病NOD小鼠的胰島β細胞株，即NIT-1細胞。
　　 1、通過MTT比色法檢測高濃度葡萄糖(33.3mM)處理以及競爭性抑制Egr-1活性后，NIT-1細胞的活力變化并計算抑制率。
　　 2、用熒光染料DAPI標記細胞核，并在熒光顯微鏡下檢測不同處理組濃集核和碎裂核的數(shù)目

4、，統(tǒng)計各組細胞總凋亡數(shù)目。
　　 3、應(yīng)用DNA片段化和流式細胞儀方法分析高糖處理條件下NIT-1細胞的早期凋亡率，同時競爭性抑制Egr-1活性后檢測NIT-1細胞的凋亡變化。
　　 4、Real-time PCR實驗檢測高糖誘導(dǎo)β細胞中Egr-1 mRNA表達水平的變化以及Western blot法在蛋白水平上檢測細胞中Egr-1的表達水平。
　　 結(jié)果:
　　 1、MTT檢測結(jié)果顯示高糖誘導(dǎo)48h后，

5、細胞活力出現(xiàn)顯著性的下降，而高糖誘導(dǎo)72h后，細胞活力下降更為明顯;然而當競爭性抑制Egr-1活性后，高糖誘導(dǎo)48h后細胞活力變化并無顯著性差異。
　　 2、DAPI染色標記核碎裂示細胞凋亡的數(shù)目的結(jié)果顯示，與對照組相比高糖處理48h后凋亡數(shù)明顯增多，而高糖處理72h后，凋亡數(shù)目差異更顯著。
　　 3、應(yīng)用DNA片段化方法和流式細胞儀方法結(jié)果均進一步證實高糖可以誘導(dǎo)NIT-1細胞的凋亡;然而當競爭性抑制Egr-1活性后，

6、高糖誘導(dǎo)的細胞凋亡得到改善。
　　 4、熒光實時定量PCR(RT-PCR)結(jié)果顯示，相比較對照組高濃度葡萄糖誘導(dǎo)NIT-1細胞凋亡增加的同時，細胞內(nèi)Egr-1 mRNA表達水平隨著處理時間的延長有明顯上調(diào)趨勢;同時Western blot檢測表明Egr-1在后期表達水平的增加極有可能是參與到了胰島β細胞的凋亡過程中。
　　 結(jié)論:本課題研究中，利用永生化的NIT-1胰島β細胞株為實驗?zāi)Ｐ停诩毎缴献C實了高糖條件可以誘

7、導(dǎo)胰島β細胞的凋亡并且早期反應(yīng)基因Egr-1參與到了高糖誘導(dǎo)β細胞凋亡的過程中并探討了其可能的初步相關(guān)機制。主要結(jié)論如下:
　　 1、高糖是引起胰島β細胞損傷和凋亡的重要誘導(dǎo)因素，提示高濃度的葡萄糖對β細胞有毒性作用。
　　 2、Egr-1參與到了高糖誘導(dǎo)的β細胞凋亡，抑制Egr-1的表達可以改善高糖刺激下β細胞的活力下降。提示Egr-1基因有可能成為防治Ⅱ型糖尿病藥物的作用潛在靶點，但是具體機制仍不明了，可能還涉及到E