高糖誘導髓核細胞凋亡的相關(guān)研究.pdf

1、背景及目的：細胞凋亡參存在于機體的整個生命過程，參與了生命過程中的各種生理及病理過程。細胞凋亡的增加或者減少是許多疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。目前研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)除了參與機體正常的生命活動，也參與了細胞的凋亡過程，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑成為新的凋亡通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路的主要機制是各種理化因素導致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress,ERS）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細胞生命過程中發(fā)揮重要作用，其主要功能是參與蛋白質(zhì)的折疊、修飾及合成。當內(nèi)

2、質(zhì)網(wǎng)受到內(nèi)外理化因素刺激時，會導致蛋白質(zhì)的代謝及合成障礙。當理化因素強烈、持續(xù)存在時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)紊亂，積累大量的未折疊或折疊錯誤的蛋白質(zhì)后，會激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑，進而導致細胞凋亡。當椎間盤髓核組織中髓核細胞大量凋亡時，即可引起椎間盤退變，進而導致一些列脊椎退行性疾病的發(fā)生。本研究旨在通將髓核細胞培養(yǎng)于含有高濃度葡萄糖的培養(yǎng)基中，探討在高糖環(huán)境中，ERS是否參與誘導兔髓核細胞的凋亡過程。
　　方法：本實驗采用胰酶聯(lián)合Ⅱ型膠原酶消化法

3、，體外分離、培養(yǎng)兔髓核細胞，經(jīng)過甲苯胺藍染色、蘇木精-伊紅染色后觀察細胞形態(tài)。通過細胞免疫組織化學染色、免疫熒光染色鑒定髓核細胞后，將第三代兔髓核細胞隨機分為四組，包括：對照組（正常培養(yǎng)基組）、高糖組（培養(yǎng)基中含有100mM葡萄糖）、Caspase-12抑制劑組（培養(yǎng)基中含有2μM氟甲基酮）和高糖+Caspase-12抑制劑組（培養(yǎng)基中含有2μM氟甲基酮及100mM葡萄糖），每組細胞按照不同的實驗條件處理6h后，分別采用CCK-8試劑盒

4、和細胞凋亡檢測試劑盒檢測各組細胞的增殖活性及凋亡情況，ROS檢測試劑盒檢測各組細胞內(nèi)的總活性氧（reactive oxygen species，ROS），PCR和Western-blot檢測各組Caspase-12和Grp78的表達變化。
　　結(jié)果：成功完成了兔髓核細胞的體外分離培養(yǎng)；髓核細胞染色后鏡下觀察呈多角形、短梭形，有一到兩個核仁，隨著傳代次數(shù)增加，細胞伸出偽足，胞體逐漸變細長；體外分離培養(yǎng)髓核細胞可穩(wěn)定表達Ⅱ型膠原蛋白。