“黃芪-葛根”藥對對乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷的保護(hù).pdf

1、背景:
　　近年來我國飲酒人群的數(shù)量以及酒精消費(fèi)數(shù)量逐年增加，因飲酒引起的消化系統(tǒng)疾病，已經(jīng)成為一個嚴(yán)重的社會問題與醫(yī)學(xué)問題。飲酒導(dǎo)致的消化系統(tǒng)疾病多為胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、酒精性肝病、肝硬化等;長期飲酒還可以誘發(fā)腸上皮化生，腸上皮化生是胃粘膜病變向胃癌過度的一個階段。
　　藥對研究是中藥復(fù)方研究的重要組成部分，也是研究中藥復(fù)方的一個突破口。黃芪—葛根藥對首見于清代醫(yī)書《證治匯補(bǔ)》中所記載的黃芪葛根湯，原方中黃芪與葛根

2、的配伍比例為2∶1，歷代多位醫(yī)家認(rèn)為此方具有解酒毒的作用。前期動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪苷類可以減輕乙醇對胃粘膜的損傷。黃芪甲苷與黃芪總苷可以促進(jìn)已損傷的胃上皮細(xì)胞GES-1的修復(fù)，其作用機(jī)制與黃芪甲苷、黃芪總苷參與細(xì)胞凋亡等相關(guān)通路有密切聯(lián)系。因此本研究以黃芪—葛根藥對為切入點(diǎn)，探討其保護(hù)胃粘膜損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)與相關(guān)機(jī)制。
　　目的:
　　優(yōu)選黃芪—葛根藥對保護(hù)胃粘膜損傷的最佳水煎工藝;建立黃芪—葛根藥對不同配伍比例的高效液相指

3、紋圖譜，通過譜效關(guān)系的研究，明確黃芪—葛根藥對中的異黃酮類成分對保護(hù)胃粘膜損傷的貢獻(xiàn)大小;初步探討黃芪—葛根藥對保護(hù)乙醇誘導(dǎo)胃粘膜損傷的機(jī)制。
　　方法:
　　1.正交試驗(yàn)結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)優(yōu)選黃芪—葛根藥對抗乙醇誘導(dǎo)胃粘膜損傷最佳水煎工藝。以黃芪—葛根藥對水煎液中葛根素的化學(xué)含量作為評價指標(biāo)，以乙醇對小鼠胃粘膜損傷分?jǐn)?shù)作為藥效指標(biāo)，設(shè)計正交試驗(yàn)，對藥對煎藥的時間、煎藥的次數(shù)、煎藥水量3個因素，分別分為3個水平進(jìn)行綜合考察，優(yōu)選

4、出黃芪—葛根藥對(2∶1配伍)保護(hù)胃粘膜的最佳水煎工藝。
　　2.高效液相色譜法建立黃芪—葛根藥對不同配伍比例(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)的指紋圖譜;將不同配伍的黃芪—葛根藥對指紋圖譜共有峰相對峰面積與小鼠胃粘膜損傷分?jǐn)?shù)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析，通過關(guān)聯(lián)度大小，明確藥對中已鑒別的異黃酮類化學(xué)成分對胃粘膜保護(hù)作用的貢獻(xiàn)度。
　　3.觀察黃芪—葛根藥對對乙醇誘導(dǎo)大鼠胃粘膜損傷的保護(hù)。測量并計算肉眼下胃粘膜損傷分?jǐn)?shù)與光鏡下病

5、理切片胃粘膜損傷分?jǐn)?shù)。HE染色病理切片觀察黃芪—葛根藥對對不同實(shí)驗(yàn)組大鼠胃粘膜損傷形態(tài)學(xué)的影響。
　　4.觀察藥對對凋亡信號通路關(guān)鍵基因與蛋白的影響。通過Real time PCR、免疫組織化學(xué)、Western-blot法檢測藥對對凋亡信號通路Bcl-2/Bax/Caspase-3基因與蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.黃芪—葛根藥對（2∶1配伍）按照煎煮3次，每次30 min，10倍水量的水煎工藝所煎煮的藥液中葛

6、根素含量（15.90±0.04mg/mL）高于其它中藥組，其小鼠胃粘膜損傷分?jǐn)?shù)(14.8±11.8)低于其它給藥組。黃芪—葛根藥對煎煮30min，煎煮3次，加10倍水作為本研究的最佳水煎工藝。
　　2.黃芪—葛根藥對不同配伍比例(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)對乙醇誘導(dǎo)小鼠的胃粘膜損傷均有保護(hù)作用，均可以降低小鼠胃粘膜的損傷分?jǐn)?shù)，其中3∶1配伍組胃粘膜損傷分?jǐn)?shù)低于其它配伍組，其保護(hù)胃粘膜損傷的效果優(yōu)于其它配伍組。與已知對

7、照品比較，鑒別出黃芪—葛根藥對中的8個異黃酮類化學(xué)成分分別是:染料木素、染料木苷、葛根素、毛蕊異黃酮、大豆苷、大豆苷元、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素。通過將HPLC指紋圖譜獲得的藥對共有峰峰面積與小鼠胃粘膜損傷分?jǐn)?shù)相關(guān)聯(lián)，得到8種異黃酮類化學(xué)成分對胃粘膜保護(hù)作用的貢獻(xiàn)度依次為:染料木素＞葛根素＞大豆苷元＞大豆苷＞芒柄花素＞毛蕊異黃酮＞染料木苷＞毛蕊異黃酮葡萄糖苷。
　　3.肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠胃組織粘膜表面呈現(xiàn)淡粉色，粘膜表面

8、連續(xù)、光滑、無破損、無充血;模型組大鼠粘膜色鮮紅、呈現(xiàn)出線狀或斑點(diǎn)狀出血;與模型組相比較，各預(yù)防給藥組粘膜損傷較輕，局部僅有少數(shù)點(diǎn)狀出血。HE染色病理切片結(jié)果顯示，正常組大鼠胃粘膜上皮細(xì)胞有很好的連續(xù)性、細(xì)胞排列緊密有序、固有層腺體排列整齊;與正常組相比較，模型組大鼠粘膜組織遭到破壞，上皮細(xì)胞脫落、壞死，腺體排列紊亂，粘膜下層水腫，腺體擴(kuò)張，有紅細(xì)胞外滲;陽性藥（西米替?。┙M與藥對高劑量藥組可見少量上皮細(xì)胞脫落，損傷情況均輕于模型組，藥

9、對中劑量組與藥對低劑組可見上皮細(xì)胞局部脫落，粘膜損傷稍重于西藥組與藥對高劑量組，但均輕于模型組。
　　4.與模型組相比，黃芪—葛根藥對可以上調(diào)Bcl-2基因的mRNA的表達(dá)，下調(diào)Bax與Caspase-3基因的mRNA的表達(dá);免疫組化與Western-blot結(jié)果顯示，與模型組相比，黃芪—葛根藥對可以上調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平，下調(diào)促凋亡蛋白Bax與Caspase-3的表達(dá)，其中西藥組與黃芪—葛根藥對高劑組的效果優(yōu)于藥對中

10、劑組與藥對低劑組。
　　結(jié)論:
　　1.正交試驗(yàn)優(yōu)選的黃芪—葛根藥對最佳水煎工藝為:煎煮3次、每次30min，10倍水量。
　　2.黃芪—葛根藥對對乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷具有保護(hù)作用，其中3∶1配伍組保護(hù)胃粘膜損傷的效果優(yōu)于其它配伍組;藥對中已鑒別的8種異黃酮化合物中染料木素保護(hù)胃粘膜損傷的貢獻(xiàn)度大于葛根素與其它異黃酮類化合物。
　　3.黃芪—葛根藥對可以減輕乙醇導(dǎo)致的胃粘膜出血、水腫、糜爛等病理損傷;其作用機(jī)制可