促生長(zhǎng)激素神經(jīng)肽在感覺(jué)和交感神經(jīng)節(jié)的表達(dá)及有關(guān)的痛覺(jué)調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、促生長(zhǎng)激素神經(jīng)肽(galanin，Gal)是一個(gè)由29/30個(gè)氨基酸(在大多數(shù)物種為29個(gè)氨基酸，在人為30個(gè)氨基酸)組成的神經(jīng)肽，在神經(jīng)系統(tǒng)有廣泛的表達(dá)，可發(fā)揮調(diào)節(jié)傷害性刺激、神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)等多種生物學(xué)功能。在周圍感覺(jué)神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和交感神經(jīng)節(jié)(sympathetic ganglion，SG)神經(jīng)元都檢測(cè)到Gal的表達(dá)。Gal在周圍神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)損傷的適應(yīng)性反應(yīng)及調(diào)節(jié)痛覺(jué)傳遞的過(guò)程中可能發(fā)揮作用。Gal被認(rèn)為是背根神經(jīng)節(jié)(dorsal

2、 root ganglion，DRG)神經(jīng)元損傷的標(biāo)志物之一和交感神經(jīng)元軸突受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)神經(jīng)元表型改變的一個(gè)標(biāo)志。在正常成年動(dòng)物，Gal在感覺(jué)神經(jīng)元和SG神經(jīng)元表達(dá)的水平很低；在周圍神經(jīng)損傷和炎癥狀態(tài)下，Gal的表達(dá)顯著上調(diào)。 外周去甲腎上腺素能系統(tǒng)與痛覺(jué)的調(diào)節(jié)有一定的關(guān)系。正常健康狀態(tài)下，去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)對(duì)痛覺(jué)的影響作用極小，在神經(jīng)損傷或炎癥時(shí)，去甲腎上腺素能系統(tǒng)發(fā)生的各種可塑性變化可影響其

3、對(duì)抗傷害性刺激的效能。不同的α-受體的亞型在交感神經(jīng)元有表達(dá)，這些受體激活后可影響交感神經(jīng)系統(tǒng)的活性或神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)或釋放，并最終導(dǎo)致不同的效應(yīng)。 感覺(jué)神經(jīng)肽和VR1的表達(dá)反映了DRG神經(jīng)元感受傷害性刺激的特性。在初級(jí)傳入神經(jīng)元表達(dá)的感覺(jué)神經(jīng)肽P物質(zhì)(substance P,SP)在介導(dǎo)傷害性刺激的過(guò)程中發(fā)揮作用，Gal和SP可在同一個(gè)DRG感覺(jué)神經(jīng)元中共存。外源性的Gal是否能影響DRG神經(jīng)元VR1以及SP的表達(dá)尚需要進(jìn)一步證

4、實(shí)。 本研究建立了DRG神經(jīng)元和頸上神經(jīng)節(jié)(superior cervical ganglion，SCG)神經(jīng)元培養(yǎng)模型，用這兩個(gè)培養(yǎng)模型，分別研究了NE、CAP、NGF對(duì)DRG神經(jīng)元Gal的表達(dá)的影響作用，NGF、6-OHDA、α-受體激動(dòng)劑對(duì)SCG神經(jīng)元Gal表達(dá)的影響作用。用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討了Gal在福爾馬林誘發(fā)的傷害性刺激中的作用及其機(jī)制。此外，NGF所致的DRG和SCG神經(jīng)元軸突再生與Gal表達(dá)的關(guān)系，CAP對(duì)DRG神經(jīng)元

5、GalR2表達(dá)的影響，外源性Gal對(duì)DRG神經(jīng)元SP釋放、VR1表達(dá)的影響作用在本實(shí)驗(yàn)中也進(jìn)行了探討。 DRG取自胚胎15 d的Wistar大鼠，SCG神經(jīng)元取自新生Wistar大鼠。DRG神經(jīng)元和SCG神經(jīng)元培養(yǎng)24 h后，再用阿糖胞苷(cytarabine，ara-C)作用24h抑制非神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)。之后，用不同的處理因素作用4 d或正常培養(yǎng)4 d后用不同的處理因素作用4 h后進(jìn)行檢測(cè)。 (1)NE及α-受體拮抗劑孵育DRG

6、神經(jīng)元：DRG神經(jīng)元用NE(10-4 mol/L)孵育4 d，或在加入NE之前10 min，在培養(yǎng)液內(nèi)預(yù)先加入α1-受體拮抗劑哌唑嗪(10-6mol/L)或α2-受體拮抗劑育亨賓(10-5mol/L)。檢測(cè)對(duì)Gal及其mRNA的表達(dá)。 (2)NGF孵育DRG神經(jīng)元：DRG神經(jīng)元用NGF(10 ng/ml)或NGF(10ng/ml)加NE(10-4 mol/L)孵育4 d，檢測(cè)Gal及其mRNA的表達(dá)及單個(gè)神經(jīng)元的軸突總長(zhǎng)度。

7、 (3)CAP孵育DRG神經(jīng)元：①DRG神經(jīng)元用不同濃度的CAP(10-8mol/L，10-7 mol/L,10 -6 mol/L)孵育4 h，檢測(cè)Gal和GalR2及其mRNA的表達(dá)；②DRG神經(jīng)元用不同濃度的CAP(10-8mol/L，10-7mol/L，10-6 mol/L)孵育4 d，檢測(cè)Gal和GalR2及其mRNA的表達(dá)。 (4)外源性Gal孵育DRG神經(jīng)元：DRG神經(jīng)元用不同濃度的Gal(10-9mol/L，1

8、0-8mol/L, 10-7mol/L)孵育4 d，檢測(cè)VR1及其mRNA、SPmRNA的表達(dá)及SP的釋放。在加入Gal之前10 min，預(yù)先加入GalR拮抗劑M35(10-8 mol/L)或PKC抑制劑CalphostinC(10-7mol/L)，檢測(cè)GalR拮抗劑及PKC抑制劑對(duì)Gal作用的影響。 (5)選擇性α-受體激動(dòng)劑孵育SCG神經(jīng)元：SCG神經(jīng)元分別用α-受體激動(dòng)劑苯腎上腺素(10-5mol/L)和α2-受體激動(dòng)劑可

9、樂(lè)定(10-5mol/L)孵育4 d，檢測(cè)Gal及其mRNA的表達(dá)。 (6)NGF或/和6-OHDA孵育SCG神經(jīng)元：SCG神經(jīng)元用NGF(10 ng/ml)、6-OHDA(10-5mol/L)、NGF(10 ng/ml)加6-OHDA(10-5mol/L)孵育4 d，檢測(cè)Gal及其mRNA的表達(dá)及單個(gè)神經(jīng)元的軸突總長(zhǎng)度。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為體重為220-250g的雄性Wistar大鼠。隨機(jī)分為5組，每組10只動(dòng)物。Ga

10、l組、福爾馬林組、福爾馬林+Gal組、福爾馬林+Gal+GalR拮抗劑組、福爾馬林+Gal+PKC抑制劑組。在大鼠左側(cè)后足底注射20μl2％的福爾馬林誘發(fā)炎癥，同時(shí)注射20μlGal(0.1 ng/μl)，之后進(jìn)行縮足反射行為學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。GalR拮抗劑(M35)在注射Gal前20 min、PKC抑制劑(CalphostinC)在注射Gal前60 min注射。Gal組、福爾馬林組分別只注射20 μl Gal(0.1ng/μl)或20 μl

11、 2％的福爾馬林。行為學(xué)檢測(cè)后，取左側(cè)腰骶部DRG和腰骶部SG，檢測(cè)Gal及其mRNA的表達(dá)。 本研究的結(jié)果顯示：(1)用NE(10-4 mol/L)孵育4 d后，培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中Gal及其mRNA的表達(dá)增加；用α1-受體阻斷劑哌唑嗪(10-6 mol/L)預(yù)處理可阻斷NE的這一效應(yīng)；用α2-受體阻斷劑育亨賓(10-5mol/L)預(yù)處理則不影響NE引起的Gal及其mRNA的表達(dá)增加。(2)用NGF(10 ng/ml)孵育4

12、d后，培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中Gal及其mRNA的表達(dá)降低；NGF還可抑制NE誘發(fā)的Gal及其mRNA表達(dá)。NGF能促進(jìn)DRG神經(jīng)元軸突再生，而NE則不能促進(jìn)DRG神經(jīng)元軸突再生。(3)CAP(10-6mol/L)急性處理(4 h)或CAP(10-8mol/L，10-7mol/L)長(zhǎng)期孵育(4 d)均可促進(jìn)Gal及其mRNA的表達(dá)，CAP(10-7mol/L)長(zhǎng)期孵育(4 d)可促進(jìn)GalR2及其mRNA的表達(dá)。(4)外源性Gal可增加DR

13、G神經(jīng)元CAP誘發(fā)的SP釋放量，但不影響SP及其mRNA的表達(dá)以及基礎(chǔ)SP釋放量。外源性Gal可促進(jìn)DRG神經(jīng)元VR1及其mRNA的表達(dá)，并呈劑量依賴方式。外源性Gal所致的DRG神經(jīng)元VR1表達(dá)增加可部分地被GalR拮抗劑M35或PKC抑制劑Calphostin C所抑制。(5)α2-受體激動(dòng)劑可樂(lè)定(10-5mol/L)可抑制SCG神經(jīng)元Gal及其mRNA的表達(dá)，α1-受體激動(dòng)劑苯腎上腺素(10-5mol/L)對(duì)SCG神經(jīng)元Gal及

14、其mRNA的表達(dá)無(wú)影響。(6)NGF(10 ng/ml)可抑制SCG神經(jīng)元Gal及其mRNA的表達(dá)；6-OHDA(10-5mol/L)孵育SCG神經(jīng)元，可促進(jìn)Gal及其mRNA的表達(dá)；聯(lián)合應(yīng)用NGF和6-OHDA，NGF不能抑制6-OHDA引起的Gal及其mRNA表達(dá)的上調(diào)，但NGF能促進(jìn)SCG神經(jīng)元軸突再生。(7)注射福爾馬林可誘發(fā)大鼠自發(fā)性疼痛行為縮足反射，注射20 μl Gal(0.1 ng/μl)可增加縮足反射的次數(shù)。在注射Ga

15、l前注射30μl(20 ng/μl)Gal受體拮抗劑M35或30μl PKC抑制劑Calphostin C(0.1ng/μl)，可部分抑制Gal引起的疼痛增強(qiáng)效應(yīng)。(8)大鼠足底內(nèi)注射福爾馬林可引起同側(cè)腰骶部DRG內(nèi)Gal mRNA表達(dá)增加，神經(jīng)肽Gal的表達(dá)無(wú)變化。腰骶部SG內(nèi)Gal及其mRNA表達(dá)均無(wú)變化。這些結(jié)果表明：(1)DRG神經(jīng)元內(nèi)Gal的表達(dá)可受NE、NGF、CAP等多種因素的影響。NE通過(guò)作用于α1-受體，而不是α2-受

16、體，增強(qiáng)了DRG神經(jīng)元Gal的表達(dá)，這可能是外周促進(jìn)傷害性刺激的腎上腺素能調(diào)節(jié)機(jī)制之一。NGF抑制DRG神經(jīng)元內(nèi)Gal的表達(dá)，一定孵育時(shí)間和孵育濃度的CAP刺激DRG神經(jīng)元，Gal及其受體GalR2表達(dá)上調(diào)。這反映了Gal所介導(dǎo)的傷害性刺激作用機(jī)制的復(fù)雜性。 (2)SCG神經(jīng)元內(nèi)Gal的表達(dá)可受α2-受體激動(dòng)劑、NGF、6-OHDA等多種因素的影響。交感神經(jīng)元α2-受體的激活對(duì)Gal的表達(dá)有抑制作用，表明α2-受體可能參與了Ga