BMSCs移植對兔頸上交感神經(jīng)節(jié)損傷保護作用的研究.pdf

1、目的：
　　將體外培養(yǎng)得到的兔骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells BMSCs）誘導分化為神經(jīng)元樣細胞，再植入兔頸上交感神經(jīng)節(jié)（Superior cervical sympathetic ganglion SCSG）損傷模型體內(nèi)，觀察瞳孔的變化，并檢測局部組織NGF、VEGF的表達情況，探討干細胞修復神經(jīng)損傷的可能機制。
　　方法：
　　選取4月大的新西蘭兔，取股骨中的

2、骨髓，經(jīng)體外培養(yǎng)獲得BMSCs,并誘導分化為神經(jīng)元樣細胞。
　　利用小號持針器鉗壓榨兔頸上交感神經(jīng)節(jié)，制備兔頸上交感神經(jīng)節(jié)損傷模型。
　　將健康成年的24只雄性新西蘭兔，完全隨機的分為四組，A組正常對照組，正常兔，不給于任何處理；B組模型對照組，頸上交感神經(jīng)節(jié)損傷后不給予其他干預(yù)；C組培養(yǎng)液干預(yù)組，頸上交感神經(jīng)節(jié)損傷后給予細胞培養(yǎng)液干預(yù)（不含細胞）；D組為BMSCs移植組，頸上交感神經(jīng)節(jié)損傷后給予神經(jīng)元樣細胞移植干預(yù)。模型制

3、作成功7天時，C組用微量注射泵經(jīng)耳緣靜脈注入培養(yǎng)液1ml，D組用微量注射泵經(jīng)耳緣靜脈注入濃度為1×109/L的神經(jīng)元樣細胞培養(yǎng)液1ml，分別于移植后1d、3d、7d、14d、21d記錄瞳孔的變化，移植21d后，處死兔，取頸上交感神經(jīng)節(jié)，進行HE染色并檢測神經(jīng)生長因子（Nerve growth factor NGF）和血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothedlial growth factor VEGF）的表達。
　　結(jié)

4、果：
　　1、成功的培養(yǎng)了兔BMSCs，利用光學顯微鏡觀察，原代兔BMSCs貼壁較少，大多數(shù)呈圓形或者類圓形，小部分呈短梭形，經(jīng)過純化、擴增后，貼壁細胞逐漸增多，表現(xiàn)為集落式生長，呈長梭形，局部呈漩渦狀；隨著傳代次數(shù)的增加，傳至6～7代，細胞生長逐漸緩慢，細胞開始呈扁平狀；免疫細胞化學染色檢測培養(yǎng)的BMSCs表面特異性標志物:CD34(一)，CD54(+)。誘導分化后細胞鑒定多數(shù)細胞神經(jīng)元特異性蛋白和巢蛋白呈陽性表達。
　　

5、2、瞳孔直徑比較，在1d、3d、7d、14d、21d時，正常對照組的瞳孔直徑（mm）分別為：7.21±0.77、7.72±0.99、7.33±0.35、7.45±0.56、7.41±0.65，模型對照組的瞳孔直徑（mm）分別為：5.25±0.30、5.00±0.66、5.27±0.45、5.39±0.24、5.30±0.49，培養(yǎng)液對照組的瞳孔直徑（mm）分別為：5.07±0.41、5.32±0.36、5.16±0.43、5.14±0.

6、49、5.41±0.84，BMSCs移植組的瞳孔直徑（mm）分別為：5.35±0.34、5.52±0.25、5.40±0.61、6.38±0.60、6.87±0.40。頸上交感神經(jīng)節(jié)損傷后模型對照組、培養(yǎng)液對照組、BMSCs移植組瞳孔和正常對照組比較明顯縮小，正常對照組瞳孔幾乎無變化，模型對照組、培養(yǎng)液對照組隨著時間的推移，瞳孔有所恢復，但變化不明顯，BMSCs移植組瞳孔逐漸恢復，在14d時明顯變大，21d時恢復更加明顯，與正常對照組的

7、差別逐漸變小。同時間點，不同組比較：模型對照組、培養(yǎng)液對照組、BMSCs移植組在1d、3d、7d、14d時間點，瞳孔直徑均明顯小于正常對照組（P<0.05）；21d時間點，模型對照組、培養(yǎng)液對照組明顯小于正常對照組、BMSCs移植組（P<0.05），BMSCs移植組與正常對照組比較無明顯差異（t=-0.469，P=0.184）；同組不同時間點比較：正常對照組、模型對照組、培養(yǎng)液對照組不同時間點比較無明顯差異（F=0.483，P=0.74

8、8；F=0.618，P=0.0.654；F=0.407，P=0.802）。BMSCs移植組不同時間點比較，差異明顯（F=13.150，P=0.000），14d、21d瞳孔直徑明顯高于1d、3d、7d（P<0.05），14d與21d比較，瞳孔直徑差異不明顯（t=-0.486，P=0.080）。
　　3、神經(jīng)節(jié) HE染色顯示：光鏡下正常對照組：神經(jīng)細胞較多，細胞形態(tài)正常，大小一致，均勻分布，間質(zhì)中幾乎沒有血管走形；模型對照組：神經(jīng)元稀

9、疏，細胞大小不一致，分布不均勻，多數(shù)細胞胞漿明顯減少、細胞核固縮，細胞間質(zhì)增生明顯，間質(zhì)中見少量血管增生；培養(yǎng)液對照組：細胞形態(tài)、間質(zhì)及血管增生情況和模型自然恢復對照組大致相當。BMSCs移植組：細胞形態(tài)大致，大小及分布較一致，少量細胞細胞核固縮，間質(zhì)增生不明顯，但間質(zhì)中可見大量血管走形。
　　4、NGF免疫組化染色(單位:個)：NGF陽性細胞數(shù)分別為：正常對照組：47.22+13.48，模型對照組：51.10+9.93，培養(yǎng)液對

10、照組：56.63+7.96，BMSCs移植組：101.49+11.79。NGF陽性細胞數(shù)表達呈上升趨勢，組間比較有差異（F=31.615， P=0.000），BMSCs移植組明顯高于正常對照組、模型對照組、培養(yǎng)液對照（t=54.267， P=0.000；t=50.382，P=0.000；t=44.859，P=0.000）；正常對照組、模型對照組、培養(yǎng)液對照組兩兩比較差異不明顯（P>0.05）。
　　5、VEGF免疫組化染色(單位:

11、個)：VEGF陽性細胞數(shù)分別為：正常對照組：13.46+2.68，模型對照組：17.62+7.22，培養(yǎng)液對照：18.91+7.26，BMSCs移植組：35.61+3.24。VEGF陽性細胞數(shù)表達呈上升趨勢，組間比較有差異（F=18.634， P=0.000）， BMSCs移植組明顯高于正常對照組、模型對照組、培養(yǎng)液對照組（t=22.147，P=0.000；t=17.987，P=0.000；t=16.693，P=0.000）；正常對照組