間充質(zhì)干細(xì)胞不同單克隆神經(jīng)分化潛能的研究.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是存在于骨髓基質(zhì)中的一種多能干細(xì)胞，它包含不同的克隆亞群，這些克隆亞群之間在細(xì)胞形態(tài)、增殖能力和細(xì)胞功能上存在差異。單細(xì)胞克?。⊿ingle Cell Cloning，SSC）是由單個(gè)細(xì)胞不斷分裂擴(kuò)增而形成一個(gè)更純的細(xì)胞群。建立MSCs的單細(xì)胞克隆，即形成MSCs的不同細(xì)胞亞群，非常適合于研究MSCs不同細(xì)胞亞群的生物特性和分化能力等方面的差異，是研究這些不同克隆亞群

2、之間差異的很好的模型。
　　 目前，MSCs移植用于治療疾病的報(bào)道已經(jīng)很多，但是MSCs療法普遍的問題是注射后能夠存留的細(xì)胞數(shù)量有限，細(xì)胞成活率卻較低。而這數(shù)量?jī)H存的細(xì)胞只有極少量的分化為神經(jīng)細(xì)胞，這是治療效率低的一大瓶頸問題。在未來的研究和臨床治療應(yīng)用中，我們渴望找到分化能力最強(qiáng)的克隆，這樣理想的克隆可以用來做優(yōu)良的種子細(xì)胞，將來利用克隆亞群針對(duì)性治療疾病對(duì)于治療效果的提高具有極其重要意義。
　　 然而，如何區(qū)分并篩選

3、出分化能力不同的MSCs克隆亞群？如果有這樣的區(qū)分亞群的標(biāo)記物，那么問題就迎刃而解了。但是，在目前的研究水平，要精確的區(qū)分MSCs分化能力不同的亞群還不太可能，目前還沒有找到區(qū)分不同克隆亞群的標(biāo)志物。
　　 我們選擇miRNA-9、Nestin和neuroD1作為研究指標(biāo)，來研究MSCs不同克隆之間神經(jīng)方向分化潛能是否存在差異，以及miRNA-9對(duì)MSCs神經(jīng)分化潛能的影響。并探討是否可以用miRNA-9來作為神經(jīng)方向分化能力差

4、異的標(biāo)記物，為今后的研究做鋪墊。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 一、MSCs的培養(yǎng)和單克隆制備
　　 培養(yǎng)全骨髓細(xì)胞，隨著換液和MSCs的增殖，可以得到純度95％以上的MSCs。原代MSCs傳代時(shí)，制備1/100μl細(xì)胞密度的細(xì)胞懸液，種植在96孔板中，每個(gè)孔加100μl細(xì)胞懸液，也就是每個(gè)孔有一個(gè)細(xì)胞，這一個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)成細(xì)胞集落，即是單克隆細(xì)胞群。
　　 二、不同單克隆miRNA-9、nestin和NeuroD1

5、的表達(dá)差異
　　 收集不同的克隆亞群，所收集的所有克隆miRNA-9的表達(dá)量的均值作為1，各個(gè)克隆miRNA-9的相對(duì)表達(dá)量與均值相比較得出。nestin和neuroD1的相對(duì)表達(dá)兩的計(jì)算也同樣。按照miRNA-9的相對(duì)表達(dá)量的差異，把收集的克隆分成三組。用Real-time PCR的方法檢測(cè)不同克隆miRNA-9、nestin和neuroD1的差異。并進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　 三、轉(zhuǎn)染miRNA-9前體，檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后mi

6、RNA-9、nestin和neuroD1的變化情況
　　 MSCs轉(zhuǎn)染miRNA-9前體，轉(zhuǎn)染時(shí)間分為0h，24h，48h，96h。分析轉(zhuǎn)染前后和不同轉(zhuǎn)染時(shí)間miRNA-9、nestin和neuroD1的變化，研究miRNA-9對(duì)MSCs神經(jīng)方向分化的作用。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 一、MSCs的培養(yǎng)和單克隆的制備
　　 原代培養(yǎng)24h后，小部分細(xì)胞貼壁，細(xì)胞梭形不明顯。48h后可見細(xì)胞集落。單細(xì)胞克隆第3

7、天時(shí)可見幾十個(gè)細(xì)胞的小集落。第5-7天集落鋪滿。不同的克隆生長(zhǎng)速度和細(xì)胞形態(tài)之間有差異。
　　 二、不同單克隆miRNA-9、nestin和neuroD1的表達(dá)差異
　　 不同克隆miRNA-9、nestin和neuroD1的表達(dá)存在差異。Nestin是神經(jīng)前體細(xì)胞的標(biāo)記物，neuroD1是神經(jīng)元的標(biāo)記物，二者的總和記為nestin+neuroD1，可以作為MSCs向神經(jīng)方向分化的標(biāo)記。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-9與n

8、estin和neuroD1的總和正相關(guān)。
　　 三、轉(zhuǎn)染miRNA-9前體，檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后miRNA-9、nestin和neuroD1的變化情況
　　 轉(zhuǎn)染后各時(shí)間段miRNA-9含量均比未轉(zhuǎn)染的MSCs miRNA-9含量增高。其中轉(zhuǎn)染24h miRNA-9含量最高，以后逐漸下降。轉(zhuǎn)染后各時(shí)間段nestin和neuroD1的表達(dá)量升高，其中72h表達(dá)量最高。說明miRNA-9能夠促進(jìn)MSCs向神經(jīng)方向分化。