人瘢痕疙瘩類間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)與多向分化潛能的研究.pdf

1、背景：
　　 瘢痕疙瘩是整形外科的常見疾病，表現(xiàn)為瘢痕組織過度生長，侵犯鄰近組織，它和良性腫瘤的生物學(xué)行為相似，由于其各種臨床治療效果均不佳，瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制也未明確，故其已成為目前整形外科的探索熱點(diǎn)。
　　 作為一種慢性的炎性的纖維增生性疾病，瘢痕疙瘩表現(xiàn)出獨(dú)特的組織學(xué)特征，包括高密度的問充質(zhì)細(xì)胞，大量的不規(guī)則螺旋狀細(xì)胞外基質(zhì)以及被稱為瘢痕疙瘩膠原的增厚的透明膠原束，肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎癥性細(xì)胞的局部浸潤，生長因子局

2、部聚集。此外，皮膚病理性瘢痕的成纖維細(xì)胞比正常皮膚的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的膠原等細(xì)胞外基質(zhì)。研究顯示在成年機(jī)體的真皮組織中含有較豐富的問充質(zhì)干細(xì)胞。目前已經(jīng)從普通嚙齒類動物及人類普通真皮中分離并鑒定出皮膚前體細(xì)胞，這種細(xì)胞表現(xiàn)出集落形成、自我更新、特殊的胚胎及間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記和多向分化能力，由于瘢痕疙瘩為皮膚來源的良性腫瘤，并且表現(xiàn)為真皮組織過度增生，因此，我們推測在瘢痕疙瘩真皮組織內(nèi)也存在類似的干細(xì)胞群體。
　　 本實(shí)驗(yàn)

3、包括以下二部分：
　　 實(shí)驗(yàn)一人瘢痕疙瘩前體細(xì)胞的提取、擴(kuò)增目的
　　 本實(shí)驗(yàn)擬建立人瘢痕疙瘩來源的前體細(xì)胞的分離、擴(kuò)增培養(yǎng)方法，并對其進(jìn)行長期傳代后的生物學(xué)特性分析(包括形態(tài)特征、增殖能力等)。比較KPC和SKP的增殖特性。探索改進(jìn)現(xiàn)有培養(yǎng)基以獲得更好的擴(kuò)增效果，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法：
　　 1.取瘢痕疙瘩患者患處、患處與正常皮膚交界處皮膚和正常人皮膚組織在無菌條件下，以PBS(含1％

4、慶大霉素)沖洗2遍后，將組織剪成5～6mm小片，泡入含有3mg/ml中心蛋白酶的PBS中，4℃下孵育過夜。將組織塊上層的表皮層輕輕剝離，真皮部分切成1mm3的小塊，放入含有4mg/ml膠原酶Ⅰ的PBS中，在37℃下消化2小時。70微米的細(xì)胞濾膜過濾，重懸浮細(xì)胞接種于未處理的75cm2培養(yǎng)瓶，加以L-DMEM培養(yǎng)基(含10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，2mM谷胺酰胺，100mM非必須氨基酸，550uM巰基乙醇)

5、，于標(biāo)準(zhǔn)條件(37℃5％二氧化碳)下培養(yǎng)。待原代細(xì)胞生長融合約70～80％后，以1～2×104cells/cm2密度種植并繼續(xù)以上述培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　 2.將同一患者來源的第一代(P1)瘢痕疙瘩前體細(xì)胞(KPC)用含2ng/ml bFGF的培養(yǎng)液以相同密度接種于培養(yǎng)瓶中，觀察細(xì)胞生長增殖情況，并取P5細(xì)胞融合達(dá)90％的KPC進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度2×103/cm2，然后以每孔相同的細(xì)胞數(shù)接種于六孔培養(yǎng)板中，于培養(yǎng)后第1～7天

6、每天依次作細(xì)胞計(jì)數(shù)，每次3孔，取平均值，繪制生長曲線。以不含bFGF的培養(yǎng)基培養(yǎng)相同細(xì)胞作為對照組。
　　 3.取第2代KPC、正常皮膚來源前體細(xì)胞(SKP)、瘢痕疙瘩與正常皮膚交界處來源前體細(xì)胞(KN)細(xì)胞克隆，反復(fù)稀釋為10個/ml后，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。于倒置相差顯微鏡下標(biāo)記單個細(xì)胞培養(yǎng)孔，14天后計(jì)算其克隆形成率(＞50個細(xì)胞記為陽性)。
　　 4.將同一患者來源的第2代(P2)KP

7、C、KN細(xì)胞，以及正常人的SKP細(xì)胞以相同密度接種于上述培養(yǎng)基中，觀察細(xì)胞生長增殖情況，繪制生長曲線。
　　 結(jié)果：
　　 1.KPC細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶后，隨著培養(yǎng)時間的延長，懸浮細(xì)胞逐漸破碎或壞死，可以通過多次換液清除。細(xì)胞可以貼壁生長，不斷分裂增殖，呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞的梭形外觀，伴長而粗大的突起，有1～3個核，圓或橢圓形，核仁清晰，約2～5個不等，少數(shù)細(xì)胞為三角形或多向形，貼壁細(xì)胞多聚集成群，以克隆樣方式生長，10～1

8、4d后，多個克隆可以合成均質(zhì)的長梭形細(xì)胞單層，細(xì)胞排列有明顯的方向性，呈平行、漩渦狀、輻射狀排列。SKP、KN細(xì)胞鏡下外觀與KPC無明顯差異。
　　 2.而用含bFGF的培養(yǎng)基，細(xì)胞形態(tài)上較纖細(xì)、梭長，且細(xì)胞增殖速度較快，3～4d后達(dá)到80％～90％，隨著傳代次數(shù)增加，增殖速度有所減慢，但仍可傳15～20代，而使用不含bFGF培養(yǎng)基培養(yǎng)的KPCs及傳代，形態(tài)上較寬大、扁平，細(xì)胞增殖速度較慢，5～7d后達(dá)到80％～90％，隨著傳代

9、次數(shù)的增加，細(xì)胞增殖更加緩慢，傳至10代時細(xì)胞基本停止生長。從增殖曲線結(jié)果看，KPCs增殖能力在含bFGF的培養(yǎng)基中＞不含bFGF的培養(yǎng)基(P＜0.05)。
　　 3.KPC、SKP、KN細(xì)胞單克隆培養(yǎng)的克隆形成率分別為68.7％，54.6％，65.4％。
　　 4.KPC和KN細(xì)胞較SKP細(xì)胞而言，具有較強(qiáng)的增殖能力(p＜0.05)；KPC細(xì)胞增殖速度較KN細(xì)胞稍快，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 結(jié)論

10、：
　　 1.從瘢痕疙瘩的真皮中可以提取出一種和SKPs類似的成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞。
　　 2小劑量bFGF能夠促進(jìn)KPCs的增殖，并能夠保持KPCs的細(xì)胞形態(tài)為長梭形，增加KPCs的傳代代數(shù)。
　　 3 KPC和KN細(xì)胞較SKP細(xì)胞而言，具有較強(qiáng)的增殖能力(p＜0.05)；KPC細(xì)胞增殖速度較KN細(xì)胞稍快，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)二人瘢痕疙瘩前體細(xì)胞的鑒定及誘導(dǎo)分化
　　 目的：
　　

11、 本實(shí)驗(yàn)旨在通過流式細(xì)胞方法鑒定人瘢痕疙瘩來源的前體細(xì)胞，明確其是否為一種類間充質(zhì)干細(xì)胞。并對其是否具有多向分化潛能進(jìn)行研究。
　　 研究方法：
　　 1.取KPC細(xì)胞(P2、P4)和KN細(xì)胞(P2)及正常皮膚SKP細(xì)胞(P2)以流式細(xì)胞方法測定CD29、CD34，CD44，CD45，CD90，CD105的表達(dá)情況。
　　 2.取長勢良好，細(xì)胞融合達(dá)80％的P2代KPC及SKP細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組每孔加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液(

12、OS)(含10-7mol/L地塞米松，10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，50ug/ml Vitamin C2m1)；對照組每孔加入含10％FBS的L-DMEM培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中。隔天換液1次，鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)的變化和生長情況。以茜素紅S法測定鈣結(jié)節(jié)生成，運(yùn)用半定量RT-PCR檢測成骨誘導(dǎo)分化過程中的成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 3.取長勢良好的P2代KPC及SKP細(xì)胞，按2×108/L密度接種于六孔板。細(xì)胞達(dá)到完全融合后，加入

13、含1μmol/L的地塞米松，0.5mmol/L的、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobuty1-1-methy1-xanthine，IBMX)，10mg/L的牛胰島素，100mmol/L的消炎痛(indomethacin)，10％FBS的H-DMEM誘導(dǎo)3天；再用含10mg/L的牛胰島素，10％FBS的H-DMEM處理1d。如此循環(huán)3次后，用含10mg/L的牛胰島素、10％FBS的H-DMEM處理7d，每隔3～4d換液1次；對照組加

14、入含10mg/L的牛胰島素，10％FBS H-DMEM，每隔3～4天換液1次。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化和生長情況。以油紅O染色法測定脂滴生成。
　　 結(jié)果：
　　 1.流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示KPC細(xì)胞(P2、P4)、SKP細(xì)胞(P2)及瘢痕疙瘩與正常皮膚交界處細(xì)胞(KN細(xì)胞)(P2)均一性可達(dá)95％以上，它們的膜抗原CD34、CD45表達(dá)均為陰性，而膜抗原CD29、CD44、CD90、CD105表達(dá)均為陽性。
　　

15、2.實(shí)驗(yàn)組的KPC及SKP加入OS誘導(dǎo)液后，第二天即可見部分細(xì)胞由長梭形逐漸變?yōu)榱⒎叫?，并進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切?，體積增大。隨著培養(yǎng)時間的延長，這種多角形細(xì)胞逐漸增多。細(xì)胞逐漸聚集形成多個散在的島狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)。此島狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸被分泌的基質(zhì)所包埋，9天左右出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)，隨著培養(yǎng)時間的延長，可觀察到較大的細(xì)胞結(jié)節(jié)，有明顯的鈣沉積。對照組細(xì)胞增殖良好，形態(tài)不變，為長梭形，見個別寬大、扁平的細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時間延長，呈克隆生長，細(xì)胞融合，但不見致密的島狀

16、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和鈣化結(jié)節(jié)。在成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的第13天用茜素紅可檢測到鈣沉積的情況，實(shí)驗(yàn)組鏡下可見散在大量橘紅色的鈣結(jié)節(jié)，茜素紅與鈣鹽形成的橘紅色的復(fù)合物，陽性細(xì)胞在KPC組鏡下見約為70～80％，SKP組約為50～60％。未進(jìn)行誘導(dǎo)的對照組結(jié)果為陰性。抽提總RNA，用半定量的RT-PCR的方法檢測成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示COL I、BSP等成骨細(xì)胞相關(guān)性基因在誘導(dǎo)之后表達(dá)明顯增強(qiáng)。
　　 3.KPCs脂肪誘導(dǎo)液加入后72h、

17、SKPs誘導(dǎo)約5～6天后可觀察到脂滴出現(xiàn)，細(xì)胞中有小脂滴出現(xiàn)主要集中于細(xì)胞核周圍，隨著細(xì)胞誘導(dǎo)時間的延長小脂滴逐漸聚集成大的脂泡，細(xì)胞逐漸增大，由原來的梭形變?yōu)閳A形或多角形。對照組誘導(dǎo)3周后，無變化，細(xì)胞內(nèi)沒有脂滴出現(xiàn)。誘導(dǎo)培養(yǎng)19天后，油紅O染色，KPC組陽性細(xì)胞約為70～80％，SKP陽性細(xì)胞約為50～60％，空白對照組則見不到脂滴。
　　 結(jié)論：
　　 人瘢痕疙瘩前體細(xì)胞為一種類問充質(zhì)干細(xì)胞樣的細(xì)胞，能夠表達(dá)多種M