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文檔簡介
1、Dlk1-Dio3印記基因簇位于小鼠的第十二號染色體末端(12qF1),以及人類的第14號染色體上(14q32)。該印記區(qū)域?qū)ε咛ズ吞ケP的生長發(fā)育起到重要的調(diào)控作用,還影響成體的新陳代謝和大腦的功能。且該區(qū)域內(nèi)各基因表達(dá)在生長發(fā)育中呈現(xiàn)一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程。CGI-2位于該區(qū)域內(nèi)miR-341和miR-1188附近,為該區(qū)域內(nèi)首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的母本甲基化而父本非甲基化的差異甲基化區(qū)域,且為結(jié)合CTCF并具有絕緣子活性的DNA功能原件。因此,本文
2、選取Dlk1-Dio3印記區(qū)域?yàn)檠芯繉ο螅捎肅RISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對CGI-2進(jìn)行長片段的基因組刪除,在細(xì)胞水平上分析CGI-2敲除后其上下游基因的表達(dá)變化。
首先,本文對細(xì)胞系內(nèi)Dlk1-Dio3印記區(qū)域中各基因表達(dá)水平進(jìn)行分析,從而篩選出三株適合敲除實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系。所選擇的三株細(xì)胞系分別為Dlk1-Dio3印記區(qū)域中各基因表達(dá)水平偏高的N2a、該印記區(qū)域中各基因表達(dá)水平較低的Hepa1-6以及非癌細(xì)胞系NIH3
3、T3。通過向?qū)NA預(yù)測網(wǎng)站設(shè)計(jì)出用于CRISPR/Cas9敲除實(shí)驗(yàn)的兩對向?qū)NA,并且構(gòu)建px330重組質(zhì)粒。
其次,在N2a細(xì)胞中進(jìn)行CGI-2敲除預(yù)實(shí)驗(yàn),選擇適合用于實(shí)驗(yàn)的向?qū)NA。隨后,分別在N2a、Hepa1-6和NIH3T3三種細(xì)胞系中進(jìn)行CGI-2的CRISPR/Cas9的基因敲除,在驗(yàn)證敲除成功的前提下通過實(shí)時(shí)定量分析的方法判斷在CGI-2缺失的情況下Dlk1-Dio3印記區(qū)域內(nèi)父母本基因的表達(dá)水平變化。其
4、結(jié)果顯示,敲除位點(diǎn)遠(yuǎn)端的Dio3并沒有明顯的變化、Dlk1有不顯著的下調(diào)趨勢;位于次遠(yuǎn)端的Mirg呈現(xiàn)出上調(diào)的趨勢,但在不同細(xì)胞系中其上調(diào)程度存在差異;而位于區(qū)域中間部分的Gtl2、Rtl1、Rian、Meg8、Irm和AB063319有顯著的上調(diào)趨勢。綜上可知,CGI-2的缺失會(huì)導(dǎo)致Dlk1-Dio3印記區(qū)域中各基因表達(dá)水平的變化,即CGI-2對該印記區(qū)域的表達(dá)具有調(diào)控作用。
最后,檢驗(yàn)在刪除CGI-2和未刪除CGI-2的兩
5、種情況下Dlk1-Dio3印記區(qū)域內(nèi)Dlk1-DMR、Gtl2-DMR、IG-DMR和CGI-1-DMR這四個(gè)差異甲基化區(qū)域的甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示,在刪除CGI-2和未刪除CGI-2的兩種情況這四個(gè)差異甲基化區(qū)域均為高甲基化狀態(tài),即未發(fā)生改變。
綜上所述,CGI-2的缺失會(huì)導(dǎo)致其所在的Dlk1-Dio3印記區(qū)域內(nèi)多種基因表達(dá)水平發(fā)生變化,且這種變化趨勢在不同細(xì)胞系中大致相同;CGI-2對該印記區(qū)域中基因表達(dá)的調(diào)控作用與該區(qū)域內(nèi)
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