人類肽鏈釋放因子eRF3與生存素survivin的相互作用研究.pdf

1、真核生物的蛋白質(zhì)合成終止需要兩種相互作用的釋放因子，第一類肽鏈釋放因子(eukaryotic release factor1，eRF1)和第二類肽鏈釋放因子(eukaryotic release factor3，eRF3)。eRF3是一種GTPase，與eRF1相互作用形成復合體，確保快速有效的肽鏈釋放。進一步研究發(fā)現(xiàn)eRF3是一種多功能蛋白質(zhì)，還參與了細胞周期調(diào)控，細胞骨架組裝和腫瘤發(fā)生等過程。哺乳動物中eRF3有兩種，分別為eRF3

2、a和eRF3b，兩者的區(qū)別在于其N末端結構域有差異。eRF3a有三種轉(zhuǎn)錄異構體，異構體1（eRF3a-F1）和2(eRF3a-F2)只有一個氨基酸不同，而異構體3(eRF3a-F3)的N末端卻缺失了約140個氨基酸。生存素survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis，IAP）家族的最小成員,該蛋白結構獨特，功能多樣，在多種人的腫瘤細胞中過表達，并在細胞分裂，細胞內(nèi)信號以及細胞凋亡等途徑中起顯著作用，因此

3、倍受關注。eRF3和survivin的功能都與細胞周期調(diào)控和腫瘤發(fā)生相關，它們是否協(xié)同作用參與了這些過程的調(diào)控是一個值得探究的問題。本研究利用酵母雙雜交和pull down分析證實了人類eRF3a-F3、eRF3b與survivin的相互作用關系，并確定了其相互作用的結構域，還對兩者進行了亞細胞共定位分析，為進一步探討細胞有絲分裂調(diào)控機制提供了重要線索。
　　本研究從人的宮頸癌細胞中克隆獲得了survivin cDNA，利用本實驗

4、室已構建的重組質(zhì)粒pcDNA3.0-heRF1和已克隆的人類eRF3a-F3和eRF3b cDNA構建了一系列酵母雙雜交重組質(zhì)粒，將這些質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，經(jīng)SD-Leu-Trp-His-Ade培養(yǎng)基嚴謹篩選后，進行β-半乳糖苷酶活性分析，發(fā)現(xiàn)表達survivin/eRF3a-F3和survivin/eRF3b的酵母菌均顯示藍色，與陽性對照組(表達eRF1/eRF3a-F3和eRF1/eRF3b)的結果一致，而陰性對照組（

5、只表達survivin、eRF3a-F3和eRF3b）未顯示藍色。結果表明eRF3a-F3和eRF3b均能與survivin相互作用。為了進一步驗證eRF3和survivin在體外的作用關系，構建了一系列原核重組表達質(zhì)粒，并將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中表達。分別利用GST及Ni-NTA親和層析純化GST融合蛋白和His融合蛋白，用于pull down實驗。將His-eRF3a-F3表達上清與結合有純化的GST-hSVV的G

6、S4B介質(zhì)結合后，洗去雜蛋白，洗脫產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析后，用抗His的抗體經(jīng)western blotting進一步鑒定，結果為陽性。另外，將GST-heRF3b表達上清與結合有純化的His-hSVV的Ni-NTA介質(zhì)相結合，洗去非特異蛋白后，洗脫產(chǎn)物同樣經(jīng)SDS-PAGE分析并用抗GST的抗體經(jīng)westernblotting進一步鑒定，結果也呈陽性。這說明eRF3a-F3、eRF3b和survivin在體外也能相互作用。
　

7、　本研究確定了eRF3和survivin相互作用的最小結構域。分別對eRF3a-F3、eRF3b和survivin進行了截短突變，共構建了7個重組質(zhì)粒:pGADT7-heRF3a-F3△1-72、pGADT7-heRF3b△1-201和pGBKT7-hSVV△1-88、pGBKT7-hSVV△1-44、pGBKT7-hSVV△1-64、pGBKT7-hSVV△1-76、pGBKT7-hSVV△77-142。酵母雙雜交結果表明eRF3與s

8、urvivin的相互作用結構域位于eRF3a-F3的1-72位氨基酸，eRF3b的131-200位氨基酸。而eRF3a-F3的1-72位氨基酸相當于eRF3a-F1的139-210位氨基酸和eRF3b的130-201位氨基酸，說明該區(qū)域是兩種蛋白質(zhì)相互作用必需的。結果還表明survivin的65-76位氨基酸是survivin與eRF3相互作用必需的結構域，其中的68EPDDD72可形成一個帶負電荷的β折疊。為了研究eRF3和survi

9、vin相互作用是否參與細胞內(nèi)活動的調(diào)控，構建了融合綠色熒光蛋白(GFP)和紅色熒光蛋白(RFP)的重組表達載體pEGFP-N1-heRF3a-F3、pEGFP-N1-heRF3b和pDsRed2-N1-hSVV，共轉(zhuǎn)染Hela細胞后，通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)過量表達GFP-eRF3a-F3和GFP-eRF3b導致綠色熒光蛋白在細胞核內(nèi)積累;同時，細胞核內(nèi)還有RFP-survivin表達的紅色熒光蛋白的分布。eRF3和survivin