真核肽鏈釋放因子eRF3a-gspt1對(duì)大鼠肝纖維化模型的作用.pdf

1、目的:我國慢性肝病中主要以慢性乙型肝炎最多,由于肝炎病毒復(fù)制,病毒刺激機(jī)體的免疫防御系統(tǒng),導(dǎo)致免疫防御系統(tǒng)的淋巴細(xì)胞在清除病毒時(shí),“誤傷”肝細(xì)胞,產(chǎn)生肝臟內(nèi)炎癥,從而誘導(dǎo)了纖維組織過度增生,致使肝纖維化。肝纖維化的病理改變主要是細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積在肝臟中,大多數(shù)慢性肝病有不同程度的肝纖維化,這是一種常見的病理基礎(chǔ),表現(xiàn)為肝細(xì)胞膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)合成增加,降解相對(duì)不足,從而使細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積在肝臟中。如果進(jìn)一步發(fā)展則會(huì)引起肝小葉改建,

2、假小葉結(jié)節(jié)形成,其中25％～40％最終發(fā)展成肝硬化和肝癌。因此,在治療慢性肝病時(shí)阻斷肝纖維化已成為一個(gè)關(guān)鍵的問題。肝纖維化是多種慢性肝病發(fā)展至肝硬化共同的病理基礎(chǔ),而目前常規(guī)肝功能檢查只能反映肝臟功能,無法測(cè)知肝纖維化程度。依據(jù)肝穿刺活體組織檢查,也難以對(duì)肝纖維化進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察及療效評(píng)估。
　　 真核肽鏈釋放因子是在真核生物中參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成終止過程中新生肽鏈釋放的一組重要的蛋白質(zhì),包括兩類,即eRF1和eRF3。有研究顯示,

3、eRF3a/gsptl是哺乳動(dòng)物翻譯終止過程中的主要因子,它的表達(dá)水平影響eRF1蛋白的穩(wěn)定性,并且決定著終止復(fù)合物的形成,因此我們?cè)诖舜卧囼?yàn)中調(diào)節(jié)了eRF3a/gsptl的表達(dá)水平,觀察不同的eRF3a/gsptl的表達(dá)水平是否對(duì)肝纖維化產(chǎn)生影響。
　　 方法:
　　 1gsptl基因克隆。采用DNA提取試劑盒提取大鼠全基因組DNA,PCR擴(kuò)增獲得gsptl。將gsptl基因克隆至eGFP-C2載體,應(yīng)用堿裂解法提取質(zhì)

4、粒,進(jìn)行雙酶切鑒定及測(cè)序分析。
　　 2肝纖維化模型建立。100只SD大鼠腹腔內(nèi)注射5％四氯化碳與橄欖油的混合物,劑量為5ml/kg,每周兩次,注射8周。造模過程動(dòng)物飼水中加入25mg/L的苯巴比妥。正常對(duì)照組大鼠14只,按模型建立組的同樣程序腹腔內(nèi)注射橄欖油8周。模型大鼠CCL4處理四周之后分別用構(gòu)建的重組質(zhì)粒處理、秋水仙堿陽性對(duì)照處理,其中質(zhì)粒處理組分為5個(gè)亞組:CCL4+eGFP-C2-gsptl質(zhì)粒0.125mg/kg每

5、周一次組(treated1)、CCL4+eGFP-C2-gsptl質(zhì)粒0.125mg/kg每周兩次組(treated2)、CCL4+eGFP-C2-gsptl質(zhì)粒0.25mg/kg每周一次組(treated3)、CCL4+eGFP-C2-gsptl質(zhì)粒0.25mg/kg每周兩次組(treated4)、CCL4+eGFP-C2-gsptl質(zhì)粒0mg/kg每周一次組(模型組),每組12只大鼠,經(jīng)尾靜脈快速注射質(zhì)粒;陽性對(duì)照組為秋水仙堿,共1

6、4只,0.14mg/kg灌胃,1次/天;陰性對(duì)照組為注射CCL4+eGFP-C2質(zhì)粒0.125mg/kg每周一次組,共12只大鼠。觀察重組質(zhì)粒對(duì)肝纖維化的治療作用。
　　 3肝功能檢測(cè)。留取血清,使用微板法檢測(cè)AST、ALT等肝功指標(biāo)變化情況。
　　 4肝組織病理檢測(cè)。第8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,提取大鼠肝組織,進(jìn)行石蠟包埋,分別行厚度5μm的連續(xù)切片,之后進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色,鏡下觀察肝組織病理變化。
　　 5

7、肝纖維化相關(guān)因子基因表達(dá)量檢測(cè)。采用熒光定量PCR(Real-TimeRT-PCR)2-ΔΔCt相對(duì)定量方法檢測(cè)纖維相關(guān)因子α-SMA、TGF-β1、CTGF、MMP13、ColⅠ在大鼠肝臟中的相對(duì)表達(dá)水平。以GAPDH基因作為內(nèi)參,將標(biāo)本間RNA的質(zhì)量和逆轉(zhuǎn)錄效率的差異進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。以各因子在正常組大鼠肝組織中的表達(dá)水平作為校準(zhǔn)樣本,比較各組織中表達(dá)水平的差異。
　　 6肝纖維化相關(guān)因子蛋白表達(dá)量檢測(cè)。采用Westernblot

8、檢測(cè)eRF3a和α-SMA的表達(dá)水平,以β-actin為內(nèi)參,比較各處理組中蛋白的表達(dá)水平的差異。
　　 結(jié)果:
　　 1gsptl基因克隆。本課題成功克隆出真核肽鏈釋放因子gsptl基因。大鼠gsptl基因的編碼區(qū)由1911個(gè)堿基組成,編碼637個(gè)氨基酸,推測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量約為80KD。
　　 2肝功能檢測(cè)。模型建立八周后取血清檢測(cè)AST、ALT水平發(fā)現(xiàn)與模型組相比質(zhì)粒處理組AST、ALT隨劑量增大而下降。

9、r>　　 3肝組織病理檢測(cè)。HE染色結(jié)果顯示正常對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞多為單核,在小葉間和匯管區(qū)基本無膠原纖維分布,僅在中央靜脈及肝竇內(nèi)有輕微的膠原纖維分布。模型組大鼠HE染色中可見肝組織正常肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞,肝細(xì)胞索排列紊亂,匯管區(qū)擴(kuò)大,大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),廣泛脂肪變性,肝細(xì)胞腫脹,小葉間和匯管區(qū)膠原纖維明顯增生。質(zhì)粒處理組大鼠HE染色與模型組相比較可見,隨劑量加大,膠原纖維明顯減少,炎細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸減少,變性的細(xì)胞逐漸減少。

10、
　　 4肝纖維化相關(guān)因子基因表達(dá)量檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示質(zhì)粒處理組纖維相關(guān)因子α-SMA、CTGF、TGF-β1、ColⅠ表達(dá)水平均明顯低于模型組,MMP13表達(dá)水平明顯高于模型組,其中treated2、treated3、treated4中CTGF表達(dá)水平明顯低于模型組(P=0.01),且treated4中CTGF表達(dá)水平明顯低于與其它組(P=0.04);treated3和treated4中TGF-β1表達(dá)水平明顯低

11、于模型組(P=0.01),而這兩組間TGF-β1表達(dá)水平?jīng)]有差異;treated3和treated4中ColⅠ表達(dá)水平明顯低于模型組(P=0.02),而treated3、treated4之間ColⅠ表達(dá)水平?jīng)]有差異;treated3、treated4中α-SMA表達(dá)水平明顯低于模型組(P=0.01),而treated3和treated4之間α-SMA表達(dá)水平?jīng)]有差異;treated3和treated4中MMP13表達(dá)水平明顯高于模型組(

12、P=0.01),而treated3和treated4之間MMP13表達(dá)水平?jīng)]有差異。
　　 5肝纖維化相關(guān)因子蛋白表達(dá)量檢測(cè)。WesternBlot檢測(cè)eRF3a蛋白、α-SMA表達(dá)情況,可見eRF3a蛋白特異性條帶,位于72KD以及95KD之間,大約為80KD左右,計(jì)算eRF3a/β-actin的比值,正常組、模型組、陰性組、陽性組和四種質(zhì)粒處理組(treated1、treated2、treated3、treated4)的相對(duì)

13、表達(dá)量分別為0.98、0.77、0.72、1.44、0.80、0.92、1.40、1.67,其中treated3、treated4中eRF3a蛋白表達(dá)水平高于模型組(P=0.03)且treated4中eRF3a蛋白表達(dá)水平高于treated3(P=0.02);α-SMA蛋白特異性條帶,大約為44KD左右,計(jì)算α-SMA/β-actin的比值,正常組、模型組、陰性組、陽性組和四種處理組的相對(duì)表達(dá)量分別為0.80、1.17、1.21、0.8

14、7、1.54、1.32、1.28、1.05,其中treated3和treated4中α-SMA蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組(P=0.01),且這兩組之間α-SMA蛋白表達(dá)水平?jīng)]有差異。
　　 結(jié)論:
　　 1對(duì)大鼠肝纖維化模型給予eGFP-C2-gspt重組質(zhì)粒處理4周后AST、ALT等生化指標(biāo)活性有所下降,說明大鼠肝組織功能損傷程度逐漸改善。
　　 2肝組織病理學(xué)檢測(cè)可見eGFP-C2-gsptl質(zhì)粒處理組大鼠肝