微進化作用在阿薩希毛孢子菌慢性感染中的研究.pdf

1、第一部分阿薩希毛孢子菌微進化株與小鼠骨髓來源樹突狀細胞共培養(yǎng)體系的構(gòu)建
　　目的：建立并優(yōu)化阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T.asahii）微進化株與野生型小鼠骨髓來源樹突狀細胞(Bone marrow-derived dendritic cell，BMDC)共培養(yǎng)體系。
　　方法：體外培養(yǎng)C57BL/6小鼠BMDC;用不同濃度比例的熱滅活T.asahii與BMDC共培養(yǎng)以篩選最優(yōu)濃度比例，檢測共培

2、養(yǎng)6h和24h時各組BMDC細胞因子的產(chǎn)生情況以選擇最佳測定時刻，用脂多糖(LPS)和β-葡聚糖(β-glucan)分別刺激BMDC以選擇適宜陽性對照;利用優(yōu)化的體系進一步檢測BMDC表面共刺激分子的激活和相關(guān)細胞因子的產(chǎn)生情況。
　　結(jié)果：BMDC與T.asahii比例為1∶5最適宜作為共培養(yǎng)的比例，24h為實驗結(jié)果最佳測定時刻，而β-glucan更適于作為陽性對照;小鼠BMDC能夠?qū).asahii進行抗原提呈并通過增加IL-

3、6和TNF-α的產(chǎn)生對其發(fā)揮抗真菌作用。
　　結(jié)論：該共培養(yǎng)體系能夠有效檢測T.asahii對小鼠BMDC的免疫原性，體系構(gòu)建成功。
　　第二部分慢性感染致微進化作用對阿薩希毛孢子菌免疫原性和毒力的影響
　　目的：初步探索慢性感染所致微進化作用對T.asahii免疫原性和毒力的影響。
　　方法：復(fù)蘇T.asahii原代株(T0)與微進化株(Tevo)并分別從肉眼、光鏡和電鏡下對比觀察兩者形態(tài);體外培養(yǎng)C57BL/

4、6小鼠BMDC并以1∶5比例分別與成活/熱滅活的T0、Tevo孢子共培養(yǎng)24h，其后檢測各組BMDC細胞因子TNF-α和IL-6的表達情況;比較感染T0與Tevo小鼠的生存率。
　　結(jié)果：T0以菌絲形態(tài)生長為主，而Tevo以孢子形態(tài)生長為主;成活Tevo刺激BMDC表達TNF-α和IL-6的水平明顯低于成活T0，而熱滅活后兩者差異消失;感染Tevo的小鼠存活率明顯高于T0。
　　結(jié)論：慢性感染所致微進化作用可能造成T.asa

5、hii通過改變菌株形態(tài)以減弱其免疫原性和毒力。
　　第三部分慢性感染致微進化作用對阿薩希毛孢子菌轉(zhuǎn)錄組的影響
　　目的：通過比較T0與Tevo的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，初步探索慢性感染致T.asahii微進化作用的分子機制。
　　方法：復(fù)蘇T0和Tevo并提取菌株總RNA;純化總RNA后富集mRNA并構(gòu)建cDNA文庫;對cDNA文庫進行測序并對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控;分別對比T0與Tevo的基因表達水平、差異表達基因、基因功能描述分

6、類和代謝通路富集。
　　結(jié)果：測序結(jié)果清晰可靠;Tevo基因表達水平的分布與T0相比存在明顯差異，共有2212個差異表達基因;與T0相比，Tevo在針對菌體自身的基因轉(zhuǎn)錄、RNA合成與代謝以及細胞組分合成與代謝等生物過程項方面的基因明顯下調(diào)，上調(diào)基因雖在生物過程、細胞組分和分子功能項上均有涉及但并不顯著，以自身DNA損傷修復(fù)、能源利用和宿主細胞干預(yù)為主;下調(diào)基因參與的代謝通路在纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸的代謝上明顯富集，上調(diào)基因參與