從單核細(xì)胞免疫防御及菌株敏感性探討抗阿薩希毛孢子菌感染的策略.pdf

1、目的:
　　阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii,T.asahii）是一種酵母樣真菌，可導(dǎo)致侵襲性、播散性感染。T.asahii導(dǎo)致的播散性毛孢子菌病，致死率高達(dá)80％。T.asahii感染人體的結(jié)局，主要與宿主的免疫防御狀態(tài)和菌株對(duì)抗真菌藥物敏感性這兩方面因素有關(guān)。本研究應(yīng)用人全基因組寡核苷酸芯片檢測(cè)了人THP-1單核細(xì)胞與T.asahii體外相互作用3小時(shí)后的基因表達(dá)譜變化，有助于理解宿主單核細(xì)胞對(duì)T.asa

2、hii感染的免疫防御機(jī)制。
　　研究表明，單核細(xì)胞的吞噬功能明顯弱于巨噬細(xì)胞，而單核細(xì)胞只占外周血白細(xì)胞總數(shù)的3％-8％，這可能是其難以抵擋T.asahii入侵，導(dǎo)致血源性、播散性感染的原因之一。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-MacrophageColony-Stimulating Factor，GM-CSF)作為一種重要的集落刺激因子，可促進(jìn)造血干細(xì)胞向中性粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞分化、增殖。我們進(jìn)一步研究

3、了GM-CSF對(duì)單核細(xì)胞吞噬、殺傷T.asahii功能的影響，探討應(yīng)用GM-CSF輔助治療T.asahii感染的可能性。
　　研究表明，T.asahii感染所致的播散性毛孢子菌病，其高死亡率與菌株耐藥及T.asahii形成生物膜的能力密切相關(guān)。由于研發(fā)新型抗真菌藥物周期長(zhǎng)，投資巨大，在已有藥物中發(fā)掘抗真菌藥物增效劑成為近年來抗真菌感染領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。為了解決臨床常見的T.asahii耐藥問題，我們查閱了國(guó)內(nèi)外關(guān)于抗真菌藥物增效劑的

4、相關(guān)文獻(xiàn)，選擇舍曲林及鹽酸小檗堿作為藥物增效劑，進(jìn)行了體外藥敏試驗(yàn)，觀察它們聯(lián)合應(yīng)用氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑及兩性霉素B對(duì)T.asahii游離細(xì)胞及生物膜是否有協(xié)同抑制作用，試圖篩選出既有協(xié)同抗菌作用，又可抑制生物膜形成的輔助治療藥物。
　　方法:
　　第一部分:人THP-1單核細(xì)胞對(duì)T.asahii感染的基因表達(dá)譜反應(yīng)
　　第二部分:粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)對(duì)人THP-1單核細(xì)胞抗T.asahii感

5、染活性的增強(qiáng)作用
　　第三部分:舍曲林、鹽酸小檗堿聯(lián)合抗真菌藥物對(duì)T.asahii游離細(xì)胞及生物膜的體外協(xié)同抗菌作用
　　結(jié)果:
　　第一部分:人THP-1單核細(xì)胞對(duì)T.asahii感染的基因表達(dá)譜反應(yīng)
　　1.人THP-1單核細(xì)胞與T.asahii體外相互作用后的基因表達(dá)譜變化:共篩選出1315個(gè)差異表達(dá)基因，其中463個(gè)基因表達(dá)明顯上調(diào)，852個(gè)基因表達(dá)明顯下調(diào)。應(yīng)用DAVID6.7進(jìn)行基因功能注釋聚類分析，

6、上調(diào)的基因共得到30個(gè)GO基因注釋聚類和1個(gè)KEGG pathway注釋聚類，下調(diào)的基因共得到33個(gè)GO基因注釋聚類和1個(gè)KEGG pathway注釋聚類。生物信息學(xué)分析提示上調(diào)的差異表達(dá)基因主要涉及固有免疫反應(yīng)、適應(yīng)性免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、凋亡和抗凋亡等生物學(xué)反應(yīng)。下調(diào)的差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞周期、有絲分裂、DNA修復(fù)等生物學(xué)過程。上調(diào)幅度最大的基因主要為編碼促炎細(xì)胞因子及趨化因子的基因。
　　2.Real time PCR驗(yàn)證

7、基因表達(dá)譜數(shù)據(jù):IL-1β、TNF-α、CCL3、NF-κB1、TLR4及NLRP3在mRNA水平的表達(dá)明顯上調(diào)，CCR2的表達(dá)明顯下調(diào)，Real time PCR與基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)同一基因的表達(dá)變化趨勢(shì)一致。
　　3.ELISA法驗(yàn)證基因表達(dá)譜數(shù)據(jù):人THP-1單核細(xì)胞與T.asahii體外相互作用3h、6h、9h及12h后，TNF-α、IL-1β及CCL3的蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），與基因表達(dá)譜同一基因的

8、表達(dá)變化趨勢(shì)一致。
　　第二部分:粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子對(duì)人THP-1單核細(xì)胞抗T.asahii感染活性的增強(qiáng)作用
　　1.GM-CSF對(duì)人THP-1單核細(xì)胞吞噬T.asahii的影響:重組人GM-CSF預(yù)孵育可使人THP-1單核細(xì)胞對(duì)T.asahii的吞噬率（相互作用1小時(shí)）從20％提高到84％左右。人THP-1單核細(xì)胞對(duì)T.asahii的吞噬率隨重組人GM-CSF濃度（100U/ml、200U/ml及400U/ml）增

9、高而升高，具有濃度依賴性。
　　2.GM-CSF對(duì)人THP-1單核細(xì)胞殺傷T.asahii功能的影響:200U/ml及400U/ml的重組人GM-CSF預(yù)孵育組，每毫升T.asahii菌落形成單位較對(duì)照組明顯減少(P＜0.05)。
　　第三部分:舍曲林、鹽酸小檗堿聯(lián)合抗真菌藥物對(duì)T.asahii游離細(xì)胞及生物膜的體外協(xié)同抗菌作用
　　1.舍曲林、鹽酸小檗堿聯(lián)合抗真菌藥物對(duì)T.asahii游離細(xì)胞的體外藥敏試驗(yàn):舍曲林單

10、藥對(duì)21株T.asahii臨床株的MIC50為4-8μg/ml，MIC100為8-32μg/ml。舍曲林與抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用可明顯降低氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B對(duì)T.asahii游離細(xì)胞的MIC50及MIC100。舍曲林與氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑及兩性霉素B對(duì)大部分T.asahii菌株均有明顯的協(xié)同抗菌作用(FICI≤0.5)。其中與兩性霉素B的協(xié)同作用最強(qiáng)，90.5％的菌株（19株）觀察到舍曲林與兩性霉素B聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同

11、抗菌作用。
　　鹽酸小檗堿單藥對(duì)所有T.asahii菌株的MIC50及MIC100均＞128μg/ml。鹽酸小檗堿與抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用可明顯降低氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B對(duì)T.asahii游離細(xì)胞的MIC50及MIC100。鹽酸小檗堿與氟康唑、及兩性霉素B對(duì)大部分T.asahii菌株均有明顯的協(xié)同抗菌作用(FICI≤0.5)。其中與兩性霉素B的協(xié)同作用最強(qiáng)，71.4％的菌株（15株）觀察到舍曲林與兩性霉素B聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)

12、同抗菌作用。
　　2.舍曲林、鹽酸小檗堿聯(lián)合抗真菌藥物對(duì)T.asahii生物膜的體外藥敏試驗(yàn):舍曲林單藥對(duì)T.asahii生物膜顯示出明顯的抑制作用(SMIC5016-32μg/ml，SMIC8032-64μg/ml)。舍曲林與抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用可明顯降低氟康唑、兩性霉素B對(duì)T.asahii生物膜的SMIC50，但對(duì)四種抗真菌藥物的SMIC80無明顯影響。舍曲林與兩性霉素B聯(lián)合應(yīng)用對(duì)T.asahii生物膜有較明顯的協(xié)同抑制作用，8

13、1％的菌株(17株）觀察到舍曲林與兩性霉素B聯(lián)合應(yīng)用對(duì)T.asahii生物膜有協(xié)同抑制作用，而舍曲林聯(lián)合應(yīng)用三種唑類抗真菌藥物對(duì)T.asahii生物膜未見明顯的協(xié)同抑制作用。
　　鹽酸小檗堿單藥對(duì)所有21株T.asahii臨床株生物膜均無明顯抑制作用（SMIC50及SMIC100均＞128μg/ml）。鹽酸小檗堿與抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用可降低氟康唑、兩性霉素B對(duì)T.asahii生物膜的SMIC50，但對(duì)四種抗真菌藥物的SMIC80無明

14、顯影響。鹽酸小檗堿聯(lián)合應(yīng)用三唑類抗真菌藥物對(duì)T.asahii生物膜未見明顯的協(xié)同抑制作用。28.6％的菌株（6株）觀察到鹽酸小檗堿與兩性霉素B聯(lián)合應(yīng)用對(duì)T.asahii生物膜有協(xié)同抑制作用，但有協(xié)同作用的比例較低，需要擴(kuò)大樣本量以進(jìn)一步驗(yàn)證兩者的協(xié)同作用。
　　結(jié)論:
　　1.本課題的基因表達(dá)譜研究在轉(zhuǎn)錄水平上揭示了宿主單核細(xì)胞對(duì)T.asahii感染的整體反應(yīng)。人THP-1單核細(xì)胞遭遇T.asahii感染，可出現(xiàn)大量抗真菌感

15、染免疫及細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)基因的差異表達(dá)。其中，表達(dá)上調(diào)幅度最高的均是編碼促炎細(xì)胞因子的基因，如TNF-α、IL-1β及CCL3等，提示人THP-1單核細(xì)胞可通過上調(diào)促炎細(xì)胞因子、趨化因子等炎性介質(zhì)的表達(dá)，產(chǎn)生強(qiáng)大的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗T.asahii感染作用。此外，部分適應(yīng)性免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)明顯上調(diào)，提示人THP-1單核細(xì)胞試圖進(jìn)一步激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)以增強(qiáng)宿主抗T.asahii感染的能力。
　　2.重組人GM-CSF可明顯增強(qiáng)人

16、THP-1單核細(xì)胞對(duì)T.asahii的吞噬、殺傷活性。應(yīng)用重組人GM-CSF輔助治療T.asahii播散性感染是一種可行的治療策略。
　　3.舍曲林有明顯的體外抑制T.asahii游離細(xì)胞及生物膜活性。對(duì)于應(yīng)用醫(yī)療植入物等有形成T.asahii生物膜風(fēng)險(xiǎn)的重癥患者，舍曲林以其明顯的抗T.asahii生物膜活性及較小的副作用，顯示出很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。舍曲林及鹽酸小檗堿可提高T.asahii對(duì)氟康唑、兩性霉素B等常用抗真菌藥的敏感性