Ras1、Cdc42、Rac1、Rho1基因在阿薩希毛孢子菌不同菌相中的表達(dá)差異.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分：Ras1、Cdc42、Rac1、Rho1基因在阿薩希毛孢子菌酵母相和菌絲相中的表達(dá)差異
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)通過研究觀察獲得阿薩希毛孢子菌(Trichosporon asahii, T.asahii)的酵母相和菌絲相，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測量Ras1、Cdc42、Rac1、Rho1基因在阿薩希毛孢子菌酵母相和菌絲相中mRNA表達(dá)量，獲得這些基因在阿薩希毛孢子菌酵母

2、相和菌絲相中的表達(dá)差異，以初步探討Ras1、Cdc42、Rac1、Rho1基因在阿薩希毛孢子菌菌相轉(zhuǎn)換中的作用。
　　方法：
　　1.采用玉米瓊脂培養(yǎng)基、35℃靜置培養(yǎng)1d、2d、5d、10d,比較觀察酵母相的形成，并統(tǒng)計(jì)菌絲生成率;采用RPMI-1640液體培養(yǎng)基、37℃、150r/min震蕩培養(yǎng)4h、8h、12h、24h，比較觀察菌絲相的形成，并統(tǒng)計(jì)菌絲生成率。
　　2.收集酵母相和菌絲相的菌懸液，分別提取總RNA

3、，并通過逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。
　　3.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測酵母相和菌絲相中Ras1、Cdc42、Rac1、Rho1基因的mRNA表達(dá)情況。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
　　結(jié)果：
　　1.酵母相和菌絲相誘導(dǎo)結(jié)果顯示:玉米瓊脂培養(yǎng)基、35℃靜置培養(yǎng)5d，可獲得足量較純酵母相，菌絲生成率為（0.40±0.53）％;RPMI-1640液體

4、培養(yǎng)基、37℃、150r/min震蕩培養(yǎng)24h可獲得足量較純菌絲相，菌絲生成率為（99.33±0.57）％。將酵母相和菌絲相兩組菌絲生成率進(jìn)行t檢驗(yàn)，t=13.93，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)意義。
　　2.目的基因和內(nèi)參基因的溶解曲線和擴(kuò)增曲線分析結(jié)果顯示:基因溶解溫度均一，擴(kuò)增特異性好，未見非特異的雙鏈DNA產(chǎn)物或引物二聚體。因此，可采用SYBR I法進(jìn)行相對(duì)定量分析。擴(kuò)增曲線均光滑平穩(wěn)，熒光吸收?qǐng)D譜的S形曲線形狀完整，符合定量

5、檢測要求。
　　3.Ras1、Cdc42、Rac1、Rho1基因在酵母相和菌絲相中表達(dá)量顯示:
　　(1)Ras1基因的表達(dá)差異:以酵母相為對(duì)照組，Ras1基因表達(dá)量設(shè)為1，則菌絲相中的Ras1表達(dá)水平明顯增高，為其25.17倍，兩組進(jìn)行t檢驗(yàn)，t=3.81，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)意義，故在酵母相和菌絲相中，Ras1基因的mRNA表達(dá)有差異。
　　(2)Cdc42基因的表達(dá)差異:以酵母相為對(duì)照組，Cdc42基因表達(dá)量

6、設(shè)為1，則菌絲相中的Cdc42表達(dá)水平明顯增高，為其14.68倍，兩組進(jìn)行t檢驗(yàn)，t=3.63，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)意義，故在酵母相和菌絲相中，Cdc42基因的mRNA表達(dá)有差異。
　　(3)Rac1基因的表達(dá)差異:以酵母相為對(duì)照組，Rac1基因表達(dá)量設(shè)為1，則菌絲相中的Rac1表達(dá)水平明顯增高，為其16.81倍，兩組進(jìn)行t檢驗(yàn)，t=3.51，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)意義，故在酵母相和菌絲相中，Rac1基因的mRNA表達(dá)有差異

7、。
　　(4)Rho1基因的表達(dá)差異:按照相對(duì)定量表達(dá)測定法，，以酵母相為對(duì)照組，Rho1基因表達(dá)量設(shè)為1，則菌絲相中的Rho1表達(dá)水平明顯增高，為其42.61倍，兩組進(jìn)行t檢驗(yàn)，t=3.90，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)意義，故在酵母相和菌絲相中，Rho1基因的mRNA表達(dá)有差異。
　　第二部分：Cdc42、Rho1基因在阿薩希毛孢子菌不同菌相中的表達(dá)差異
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)旨在通過不同培養(yǎng)時(shí)間下獲得阿薩希毛孢

8、子菌標(biāo)準(zhǔn)株不同菌懸液，且通過培養(yǎng)4株不同來源的菌株，分別測量標(biāo)準(zhǔn)株不同培養(yǎng)時(shí)間下Cdc42、Rho1基因的表達(dá)差異，以及在4株不同來源菌株中Cdc42、Rho1基因的表達(dá)差異。
　　方法：
　　1.采用YPD液體培養(yǎng)基，37℃、150r/min震蕩培養(yǎng)阿薩希毛孢子菌標(biāo)準(zhǔn)株CBS2479，分別培養(yǎng)3h、6h、12h、20h，以獲得標(biāo)準(zhǔn)株不同培養(yǎng)時(shí)間下的菌懸液。
　　2.收集各條件培養(yǎng)下的菌懸液，分別提取總RNA，并通過逆

9、轉(zhuǎn)錄合成第一鏈eDNA。
　　3.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各條件培養(yǎng)下的不同菌懸液中Cdc42、Rho1基因的mRNA表達(dá)情況。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
　　結(jié)果：
　　1.標(biāo)準(zhǔn)株不同培養(yǎng)時(shí)間下菌絲誘導(dǎo)結(jié)果顯示:3h菌絲生成率為（9.00±3.61）％;6h菌絲生成率為（36.00±5.29）％;12h菌絲生成率為（77.67±6.81）

10、％;20h菌絲生成率為（44.00±5.29）％。各時(shí)間點(diǎn)菌絲生成率進(jìn)行單因素方差分析，組間比較有顯著差異(F=83.26，P＜0.05)，多重比較法分析，除6h與20h比較無顯著差異外(P＞0.05)，余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)。
　　2.不同來源菌株菌絲誘導(dǎo)結(jié)果顯示:環(huán)境株CBS8904菌絲生成率為（1.75±0.43）％;臨床株BZP09001菌絲生成率為（57.20±7.52）％;標(biāo)準(zhǔn)株CBS2479菌絲生成

11、率為（72.26±5.73）％;環(huán)境株CBS8520菌絲生成率為（97.00±4.36）％。不同來源菌株菌絲生成率進(jìn)行單因素方差分析，組間比較有顯著差異(F=235.64，P＜0.05)，多重比較法分析，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)。
　　3.目的基因和內(nèi)參基因的溶解曲線和擴(kuò)增曲線分析結(jié)果顯示:基因溶解溫度均一，擴(kuò)增特異性好，未見非特異的雙鏈DNA產(chǎn)物或引物二聚體。因此，可采用SYBR I法進(jìn)行相對(duì)定量分析。擴(kuò)增曲線均光

12、滑平穩(wěn)，熒光吸收?qǐng)D譜的S形曲線形狀完整，符合定量檢測要求。
　　4.Cdc42、Rho1基因在不同菌相中表達(dá)量顯示:
　　(1)不同培養(yǎng)時(shí)間下Cdc42基因的表達(dá)差異:以3h為對(duì)照組，表達(dá)量設(shè)為1，則6h表達(dá)量為其10.16倍，12h表達(dá)量為其20.10倍，20h表達(dá)量為其5.89倍，多組進(jìn)行單因素方差分析，組間比較有顯著差異（F=13.15，P＜0.05），多重比較法分析，其中3h表達(dá)量顯著低于12h表達(dá)量(P＜0.05)

13、，余各組間表達(dá)量比較無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）。
　　(2)不同來源菌株Cdc42基因的表達(dá)差異:以BZP09001為對(duì)照組，表達(dá)量設(shè)為1，則CBS8904表達(dá)量為其0.30倍，CBS2479表達(dá)量為其1.73倍，CBS8520表達(dá)量為其4.07倍，多組進(jìn)行單因素方差分析，組間比較有顯著差異(F=12.11，P＜0.05)，多重比較法分析，其中CBS8520表達(dá)量顯著高于其余各組表達(dá)量(P＜0.05)，余各組間表達(dá)量比較無統(tǒng)計(jì)意義

14、（P＞0.05）。
　　(3)不同培養(yǎng)時(shí)間下Rho1基因的表達(dá)差異:以3h為對(duì)照組，表達(dá)量設(shè)為1，則6h表達(dá)量為其2.79倍，12h表達(dá)量為其5.10倍，20h表達(dá)量為其2.10倍，多組進(jìn)行單因素方差分析，組間比較有顯著差異(F=39.98，P＜0.05)，多重比較法分析，除6h與20h表達(dá)量比較無顯著差異外(P＞0.05)，余各組間表達(dá)量比較均有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05）。
　　(4)不同來源菌株Rho1基因的表達(dá)差異:以B

15、ZP09001為對(duì)照組，表達(dá)量設(shè)為1，則CBS8904表達(dá)量為其0.40倍，CBS2479表達(dá)量為其1.24倍，CBS8520表達(dá)量為其2.75倍，多組進(jìn)行單因素方差分析，組間比較有顯著差異(F=30.16，P＜0.05)，多重比較法分析，其中CBS8520表達(dá)量顯著高于其余各組(P＜0.05)，CBS2479表達(dá)量顯著高于CBS8904表達(dá)量(P＜0.05)，余各組間表達(dá)量比較均無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　

16、　1.玉米瓊脂培養(yǎng)基、35℃靜置培養(yǎng)5d，可獲得阿薩希毛孢子菌酵母相;RPMI-1640液體培養(yǎng)基、37℃震蕩培養(yǎng)24h，可獲得阿薩希毛孢子菌菌絲相，方法簡便易行。
　　2.不同培養(yǎng)條件下，阿薩希毛孢子菌菌絲生成率不同，說明培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間可以影響阿薩希毛孢子菌的菌絲形成，且不同來源菌株在相同培養(yǎng)條件下菌絲生成率也不同，說明菌絲生成與菌株來源也密切相關(guān)。
　　3.在酵母相和菌絲相中，阿薩希毛孢子菌的Ras1、Cdc42、Ra

17、c1、Rho1基因皆有表達(dá)，但在酵母相中只有少量表達(dá)，轉(zhuǎn)化為菌絲相后表達(dá)量明顯增加，說明Ras1、Cdc42、Rac1、Rho1基因并非阿薩希毛孢子菌的菌絲特異基因，但在促進(jìn)阿薩希毛孢子菌的細(xì)胞極性生長、菌絲生成方面可能發(fā)揮作用。
　　4.不同培養(yǎng)時(shí)間下，阿薩希毛孢子菌菌絲生成率不同，且隨著菌絲生成率的升高，Cdc42、Rho1基因的表達(dá)量也升高，進(jìn)一步說明Cdc42、Rho1是參與阿薩希毛孢子菌標(biāo)準(zhǔn)株從酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)化調(diào)控的基

18、因，在其菌相轉(zhuǎn)化中可能起著重要作用。
　　5.不同來源菌株菌絲生成率也不同，且隨著菌絲生成率的升高，Cdc42、Rho1基因的表達(dá)量也升高，且CBS8904菌株基本為酵母相，而CBS8520菌株基本為菌絲相，兩者Cdc42、Rho1基因表達(dá)量差異顯著，從另一方面說明Cdc42、Rho1基因與阿薩希毛孢子菌的菌絲生長相關(guān)。因Rac1、Ras1與Cdc42、Rho1同屬于Ras家族蛋白，推測Ras1、Cdc42、Rac1、Rho1在阿