人外周血單核源樹突狀細胞在阿薩希毛孢子菌感染中作用的研究.pdf

1、目的：
　　阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T. asahii）是一種重要的條件致病性真菌，在免疫功能低下的人群中可引起嚴重的深部感染，導致播散性毛孢子菌病，其病死率高達77％。近年來，該病的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。既往研究發(fā)現(xiàn)T.asahii對目前大部分的抗真菌類藥具有一定的耐藥性，氟康唑、兩性霉素B單獨及聯(lián)合用藥治療失敗的案例已有報道。然而，目前 T.asahii感染的發(fā)病機制尚未完全闡明，因此，了解機體

2、在T.asahii感染過程中參與的免疫應答反應，可能為進一步研發(fā)有效的治療措施提供免疫學理論基礎(chǔ)。本研究通過構(gòu)建外周血單核源樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）與T.asahii體外共孵育模型，旨在觀察T.asahii對健康人外周血單核源DCs吞噬、表型CD80、CD86、CD83及功能的影響，初步探究DCs在T.asahii感染中可能發(fā)揮作用。
　　方法：
　　密度梯度離心聯(lián)合體外誘導培養(yǎng)的方法獲得健康人外

3、周血單核源 DCs；不同濃度的熱滅活T.asahii孢子懸液與DCs共孵育24小時（DCs與T.asahii濃度比分別為1︰1、1︰5和1︰10），RPMI-1640及LPS刺激組分別作為空白對照組及陽性對照組。瑞氏-姬姆薩染色觀察實驗組DCs對不同濃度T.asahii的吞噬率；流式細胞術(shù)檢測各組DCs表面共刺激分子CD80、CD86、CD83表達情況；雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測各組上清液中細胞因子IL-12、IL-1

4、0分泌情況；收集24小時后各組DCs與T淋巴細胞共孵育72小時（DCs與T細胞濃度比為1：10），MTT法檢測各組T淋巴細胞增殖率。
　　結(jié)果：
　　1. DCs誘導過程中的形態(tài)變化及鑒定
　　細胞培養(yǎng)的不同時期（第0天、3天、5天）觀測到了典型的DCs形態(tài)學特征，培養(yǎng)第5天的細胞表面表達 CD11c（DCs特異性標志）的比率達(97.57±1.11)%（n=3），CD11c+細胞表面共刺激分子CD80、CD86表達率

5、較低，CD83幾乎無表達，說明此時DCs大多數(shù)是未成熟DCs，且DCs活力＞95%，成功獲得后續(xù)實驗所需DCs細胞。
　　2. DCs受不同處理因素刺激24h后形態(tài)變化
　　不同濃度（DCs與T.asahii濃度比分別為1︰1、1︰5和1︰10）的熱滅活T.asahii孢子與DCs共孵育24小時后，與空白對照組相比，DCs鏡下形態(tài)發(fā)生顯著改變，細胞表面毛刺樣結(jié)構(gòu)明顯增多，形狀更加不規(guī)則，且T.asahii孢子濃度越高，DCs

6、細胞形態(tài)變化越明顯，但變化無LPS組明顯。
　　3.實驗組DCs對不同濃度T.asahii的吞噬情況
　　共孵育30min時，鏡下即可見DCs對T.asahii孢子的吞噬現(xiàn)象，24h時參與吞噬的DCs數(shù)量增加，DCs內(nèi)吞噬的T.asahii孢子數(shù)增多，且吞噬率具有真菌濃度依賴性，各組間吞噬率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　4.各組DCs表面共刺激分子CD80、CD86、CD83表達情況
　　與不同濃度 T

7、.asahii孢子共孵育24h后，與空白對照組相比，DCs細胞表面共刺激分子CD80、CD86及CD83的表達升高，具有真菌濃度依賴性，各組間差異有統(tǒng)計學意義，但均低于LPS刺激組（P＜0.05）。
　　5.各組細胞上清液中細胞因子IL-12、IL-10分泌情況
　　與不同濃度 T.asahii孢子共孵育24h后，與空白對照組相比，細胞培養(yǎng)液上清液中細胞因子IL-12、IL-10濃度明顯升高，具有真菌濃度依賴性，各組間差異有

8、統(tǒng)計學意義，但均低于LPS刺激組（P＜0.05）。
　　6.不同處理組DCs促進T淋巴細胞增殖能力
　　與不同濃度 T.asahii孢子共孵育24h后，與空白對照組相比，刺激指數(shù)（stimulation index,SI）明顯升高，具有真菌濃度依賴性，各組間差異具有統(tǒng)計學意義，但均低于LPS刺激組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. DCs對T.asahii孢子具有較強的吞噬功能，參與了機體抗T.asahii