吞噬細胞限制李斯特菌增殖的新型防御機制研究.pdf

1、胞內(nèi)菌能在宿主細胞內(nèi)存活和繁殖，并通過宿主細胞的遷移導致胞內(nèi)菌感染的擴散。結(jié)核分枝桿菌、傷寒沙門菌、志賀菌和李斯特菌等均屬于胞內(nèi)菌。這些細菌對于人類健康造成很大的危害。每年約有上千萬人感染胞內(nèi)菌，其中有超過兩百萬人死于胞內(nèi)菌感染疾病。
　　已有文獻報道發(fā)現(xiàn)某些胞內(nèi)菌感染時能夠?qū)е滤拗骷毎麅?nèi)Rab蛋白表達的變化，Rab蛋白控制著胞內(nèi)吞噬體的成熟過程。如結(jié)核分枝桿菌感染后細胞內(nèi)Rab10、Rab20和Rab32均上調(diào)。而且Rab蛋白在

2、自噬體形成過程中也有重要的調(diào)控作用。目前已證實Rab32在傷寒沙門菌和麻風分枝桿菌感染中具有重要作用。我們的前期結(jié)果證實，DC2.4細胞中Rab32缺失時，李斯特菌感染后細胞載菌量較對照組明顯增加。
　　李斯特菌是一種典型的胞內(nèi)菌，能夠侵入吞噬細胞和非吞噬細胞。宿主細胞能夠識別病原體，吞噬細菌形成吞噬體，最后形成吞噬溶酶體降解細菌。當吞噬體內(nèi)pH值下降時李斯特菌分泌李斯特菌溶血素(listeriolysinO，LLO)，破壞吞噬體

3、膜導致李斯特菌進入胞漿，胞漿內(nèi)的李斯特菌和含菌囊泡被分離膜包裹形成自噬體來降解細菌。已有文獻報道李斯特菌分泌的ActA蛋白能幫助細菌逃避自噬。
　　為了闡明Rab32在樹突狀細胞影響李斯特菌感染的作用和機制，我們構建了樹突狀細胞條件敲除Rab32基因的小鼠、慢病毒轉(zhuǎn)染Rab32基因或LC3基因的細胞，以及RNA干擾Atg5基因的細胞，通過動物和細胞載菌量實驗，激光共聚焦顯微鏡技術和高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)，系統(tǒng)地研究了Rab32在樹突狀

4、細胞感染李斯特菌中的作用。本研究的主要內(nèi)容如下:
　　1、通過基因敲除技術構建樹突狀細胞條件敲除Rab32基因的小鼠，我們能夠觀察樹突狀細胞中Rab32對于李斯特菌感染的影響。結(jié)果顯示樹突狀細胞條件敲除Rab32基因小鼠生長發(fā)育未見異常。而且流式細胞術結(jié)果表明小鼠脾臟和外周淋巴結(jié)中樹突狀細胞的數(shù)量和表型未有明顯變化。通過尾靜脈注射制備李斯特菌系統(tǒng)感染模型，我們能夠觀察樹突狀細胞中Rab32對于李斯特菌增殖的影響。組織載菌量實驗發(fā)現(xiàn)

5、李斯特菌感染3天后，樹突狀細胞條件敲除Rab32基因小鼠脾臟和肝臟組織細菌增殖明顯上升。實驗證實Rab32影響了李斯特菌在小鼠組織中的增殖。
　　2、通過體外誘導培養(yǎng)骨髓來源的樹突狀細胞(Bone marrow derived dendriticcells，BMDCs)進行細胞載菌量實驗，我們能夠明確Rab32對于李斯特菌在樹突狀細胞中增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)李斯特菌感染后，Rab32缺失BMDC載菌量明顯上升，以5h時為甚。為了明確

6、樹突狀細胞內(nèi)Rab32與李斯特菌的相互作用，我們構建了EYFP-Rab32過表達的DC2.4細胞，通過高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)分析RFP表達李斯特菌感染的細胞，發(fā)現(xiàn)Rab32囊泡能夠包裹細菌，且李斯特菌逃逸后Rab32仍能包裹細菌。接著，通過體外誘導培養(yǎng)骨髓來源的巨噬細胞(Bone marrow derived macrophages，BMDMs)和腹膜巨噬細胞(peritoneal macrophages)的細胞載菌量實驗，以及過表達EYF

7、P-Rab32的RAW264.7細胞的影像學實驗，我們進一步明確Rab32抗菌作用在吞噬細胞中普遍存在。
　　3、為了研究Rab32囊泡在李斯特菌感染的哪些階段發(fā)揮作用，我們利用△hly李斯特菌不能從吞噬體中逃逸的特性和△actA李斯特菌不能遷移的特性，通過BMDC細胞載菌量實驗發(fā)現(xiàn)Rab32缺失導致兩種細菌增殖明顯上升，Rab32在李斯特菌感染的多個階段發(fā)揮抑菌作用。為了直觀地監(jiān)測Rab32囊泡在李斯特菌感染過程中的作用，我們采

8、用激光共聚焦顯微鏡進行熒光實時影像觀察，發(fā)現(xiàn)無論細菌是否逃逸，Rab32囊泡均能包裹細菌，且Rab32囊泡內(nèi)的細菌不能增殖。為了了解Rab32囊泡與自噬之間的關系，我們采用RNA干擾Atg5基因和高內(nèi)涵圖像分析技術進行實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Atg5缺失細胞內(nèi)Rab32囊泡數(shù)量并未發(fā)生明顯變化。為了進一步了解自噬對于Rab32囊泡功能的影響，我們進行了細胞載菌量實驗，結(jié)果顯示干擾Atg5基因后，Rab32缺失BMDC中李斯特菌增殖明顯更多。高內(nèi)涵

9、圖像分析結(jié)果顯示雖然Rab32囊泡與LC3存在共定位，但數(shù)量很少;而且Rab32與LC3雙陽性囊泡的變化趨勢與Rab32囊泡不同，感染2h的細胞內(nèi)Rab32囊泡最少，而雙陽性囊泡最多。結(jié)果表明Rab32囊泡并不完全依賴于自噬發(fā)揮作用。
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)了Rab32具有限制李斯特菌增殖的作用，且Rab32作用并不僅僅存在于樹突狀細胞，而是吞噬細胞中普遍存在的機制。Rab32在李斯特菌感染的多個階段，甚至在李斯特菌逃逸后仍能發(fā)揮抑菌