APOL1基因變異的檢測及與高血壓腎病的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、目的:建立APOL1（Apolipoprotein L1）基因變異和MYH9（Nonmuscle Myosin Heavy Chain9）基因單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）的檢測方法，探討APOL1基因變異頻率以及MYH9基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）與我國漢族人群高血壓腎病的相關(guān)性。
　　方法：經(jīng)系統(tǒng)化采集、整合患者臨床信息，篩選研究對(duì)象，調(diào)查患者病史，復(fù)查血壓，檢查眼底和/

2、或心超，檢測血/尿肌酐和白蛋白、尿白蛋白/肌酐比值，臨界者加做腎 B超或穿刺，確認(rèn)納入病例組。對(duì)照組為來寧波市泌尿腎病醫(yī)院體檢的漢族健康成年人，年齡40歲以上，無原發(fā)性高血壓病史。所有研究對(duì)象均排除惡性腫瘤、內(nèi)分泌性疾病、糖尿病、心腦血管疾病等。提取病例組和對(duì)照組外周血基因組 DNA，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。設(shè)計(jì) APOL1基因外顯子引物，通過NCBI-Gene檢索確認(rèn)人類APOL1基因序列（NM_145343.2）。采用Primer5

3、.0軟件分別設(shè)計(jì)APOL1基因外顯子引物，設(shè)計(jì)好的引物委托深圳華大基因有限公司合成。擴(kuò)增APOL1基因，使用2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物純化后送深圳華大基因有限公司測序，以期發(fā)現(xiàn)APOL1基因在病例組和對(duì)照組的變異。獲取MYH9基因SNPs，通過HapMap數(shù)據(jù)庫查找中國人群的遺傳信息，采用Tagger Pairwise法（RSquare cut off=0.8，MAF cut off=0.2）獲取MYH9基因所有SN

4、Ps信息。用SNP功能注釋系統(tǒng)（SNPView系統(tǒng)、SNPper系統(tǒng)等）進(jìn)行 SNP的功能分析和預(yù)測，確定與項(xiàng)目研究對(duì)象高度相關(guān)的6個(gè)待測人類MYH9基因SNPs。設(shè)計(jì)MYH9基因SNPs引物，通過NCBI-SNP-dbSNP查找6個(gè)待測人類MYH9基因SNPs（rs1005570、rs2413396、rs80338826、rs3752462、rs11089788、Rs2269529）對(duì)應(yīng)的基因序列，采用Primer-blast軟件分別

5、設(shè)計(jì)6個(gè)MYH9基因SNPs的引物，委托上海祥音生物科技有限公司合成。擴(kuò)增MYH9基因，鑒定PCR產(chǎn)物，采用酶純化法純化目標(biāo)DNA片段，委托上海祥音生物科技有限公司進(jìn)行SNaPshot PCR檢測。以期發(fā)現(xiàn)MYH9基因單核苷酸多態(tài)性在病例組和對(duì)照組的不同。
　　結(jié)果：經(jīng)詳細(xì)的臨床診斷和入組標(biāo)準(zhǔn)篩選，確認(rèn)納入高血壓腎病患者200例，其中男104例，女96例。年齡40～85歲，平均年齡64.4±10.2歲。確認(rèn)納入對(duì)照組208例，其中

6、男94例，女114例。年齡40～87歲，平均年齡60.2±11.7歲。病例組和對(duì)照組在年齡上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.001）。檢索 APOL1基因發(fā)現(xiàn)，APOL1基因序列總共有7個(gè)外顯子，第一個(gè)外顯子因?yàn)闊o蛋白質(zhì)編碼功能故不設(shè)計(jì)引物，第2～6外顯子各設(shè)計(jì)1對(duì)引物，第7外顯子序列長度為883 bp，為便于檢測，設(shè)計(jì)了2對(duì)引物。應(yīng)用Sanger測序法對(duì)APOL1基因進(jìn)行測序，測序結(jié)果經(jīng)Mutation Surveyor4.0.4軟件處理

7、，病例組共檢出17例稀有變異，稀有基因變異檢出頻率8.5%（17/200）。對(duì)照組沒有稀有變異。病例組和對(duì)照組均檢出3個(gè)SNPs。去除dbSNP中已收錄的變異、去除1000 genome和E SP數(shù)據(jù)庫中頻率大于1%（顯性）或5%（隱性）的變異、去除同義變異之后，利用 MutationTaster（http://www.mutationtaster.org），Polyphen-2（http://genetics. bwh.harvard

8、.edu/pph2）和 SIFT（http://sift.jcvi.org）網(wǎng)站對(duì)所有未及報(bào)道的錯(cuò)義突變、插入突變、移碼框突變等可能影響蛋白功能的變異進(jìn)行功能預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其中只有2例是第五外顯子的稀有變異，可能機(jī)制是這2例具有使蛋白質(zhì)功能缺失的突變（loss of function mutation），而其他稀有變異可能是良性變異，沒有致病性。我們應(yīng)用SNaPshot技術(shù)檢測MYH9基因6個(gè)SNPs，檢測結(jié)果使用ABI公司的Genemap

9、per4.0軟件進(jìn)行分析，MYH9基因6個(gè)SNPs的基因型均檢測出來。
　　結(jié)論：本研究應(yīng)用Sanger測序法對(duì)APOL1基因進(jìn)行測序，病例組共檢出17例稀有變異，檢出頻率8.5%（17/200）。對(duì)照組無稀有變異。其中只有2例稀有變異是可能具有使蛋白質(zhì)功能缺失的突變，且在病例組具有重現(xiàn)性，表明APOL1基因變異可能與高血壓腎病相關(guān)。APOL1基因的3個(gè)SNPs可能與寧波地區(qū)漢族人群高血壓腎病無關(guān)。APOL1基因編碼的APOL1蛋