2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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1、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一種世界性的危害多種作物的重要植物病原菌,其寄主包括世界上主要的油料作物之一油菜,造成油菜的莖、葉和角果的腐爛,導(dǎo)致嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。目前雖然采用“以抗病品種為基礎(chǔ)、化學(xué)防治為加強(qiáng)措施,輔以其它防治方法”的油菜菌核病綜合防治措施,但至今為止還沒有發(fā)現(xiàn)完全免疫或者高抗的油菜品種,目前抗病品種的抗病水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到生產(chǎn)需求,而化學(xué)防治成本高、污染環(huán)境、花期人工噴藥困難,導(dǎo)致實(shí)際噴藥防

2、治面積很小,利用微生物源制劑的生物防治技術(shù)還未能在生產(chǎn)上推廣。油菜菌核病的有效防治需要開辟新的途徑,研發(fā)新的技術(shù)。
  在油菜菌核病的侵染循環(huán)中,油菜葉和莖病斑的90%以上來自于花瓣介導(dǎo)的侵染,而角果的侵染主要由于與被侵染莖葉的接觸。如能阻止病原侵染花瓣或在花瓣中殺死病原菌,即能基本阻斷菌核病侵染循環(huán),從而提高油菜菌核病的防控水平。針對(duì)這個(gè)侵染循環(huán),本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)了一種技術(shù)路線,即利用花瓣作為生物反應(yīng)器,在其中特異、高量、持續(xù)、穩(wěn)定

3、地表達(dá)抑菌物質(zhì),就地殺死病菌,達(dá)到阻止病害侵染循環(huán)、防治病害的目的。該生物反應(yīng)器的關(guān)鍵元件是:1)特異、高效、持續(xù)表達(dá)的油菜花瓣啟動(dòng)子,2)高效的抑菌基因,3)表達(dá)產(chǎn)物的有效胞外運(yùn)輸和抗降解能力。本文的研究集中在抗菌肽篩選和元件的組裝。主要結(jié)果如下。
  1、油菜高效抗菌肽的篩選??咕模ˋntimicrobial Peptides,AMPs)是一類具有抑菌活性的天然小分子蛋白,廣泛存在于生物界,是機(jī)體非特異性免疫的重要組成部分,

4、在體內(nèi)外均具有抑菌活性。本研究首先通過生物信息學(xué)的手段在油菜全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行抗菌肽基因的預(yù)測(cè)和分析,初步篩選出40個(gè)與已知抗菌肽具有類似序列結(jié)構(gòu)特征的候選基因。然后人工合成并純化,再裝入pET30a-EDDIE-GFP表達(dá)載體上,在大腸桿菌中表達(dá)。通過包涵體融合蛋白的體外復(fù)性和EDDIE的自我剪切,獲得不附加任何多余氨基酸的抗菌肽產(chǎn)物。通過抑菌活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)篩選出32個(gè)對(duì)細(xì)菌具有強(qiáng)抑菌活性的抗菌肽基因,24個(gè)對(duì)核盤菌具有較強(qiáng)的抑菌活性。

5、
  2、一個(gè)新型油菜脯氨酸富集類抗菌肽的獲得。脯氨酸富集類抗菌肽最早發(fā)現(xiàn)于昆蟲和動(dòng)物中,尚未在植物中發(fā)現(xiàn)這一類型的抗菌肽基因。本研究首次在植物中發(fā)現(xiàn)了脯氨酸富集類抗菌肽基因,其編碼的35個(gè)氨基酸序列中含有13個(gè)脯氨酸,脯氨酸含量大于35%,我們將它命名為BnPRP1,BnPRP1與來源于豬的脯氨酸富集類抗菌肽SP-B同源性為40.5%,同時(shí)在油菜中發(fā)現(xiàn)四個(gè)同源性序列,在油菜親本種白菜和甘藍(lán)中各發(fā)現(xiàn)兩個(gè)同源性序列。圓二色譜結(jié)果顯示

6、BnPRP1二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)卷曲為主,含有少量α-螺旋結(jié)構(gòu)。抑菌活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BnPRP1具有較強(qiáng)抗細(xì)菌和抗真菌活性,對(duì)核盤菌具有較強(qiáng)的抑菌活性。qRT-PCR檢測(cè)了BnPRP1基因表達(dá)是否受病原侵染的影響(誘導(dǎo)或抑制或不受影響)。結(jié)果顯示BnPRP1基因的表達(dá)受病原侵染的影響。在核盤菌接種后48h,感病品種中表達(dá)量顯著提高,而在抗病品種中呈現(xiàn)小幅的下降。這些結(jié)果表明BnPRP1基因可能在油菜菌核病防御反應(yīng)中發(fā)揮了一定的作用。

7、>  3、花瓣生物反應(yīng)器初步組裝?;谏鲜鏊悸?,首先利用35S啟動(dòng)子、前人已研究較為透徹的蘿卜抗菌肽基因Rs以及文獻(xiàn)報(bào)道的水稻α-淀粉酶信號(hào)肽αAmy3SP為元件,構(gòu)建載體,轉(zhuǎn)化擬南芥。結(jié)果表明所克隆的蘿卜抗菌肽基因Rs和信號(hào)肽αAmy3SP基因大小正確,用信號(hào)肽+GFP的實(shí)驗(yàn)表明信號(hào)肽能將GFP準(zhǔn)確定位到細(xì)胞間隙;轉(zhuǎn)擬南芥實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,4個(gè)轉(zhuǎn)基因純系的Rs表達(dá)量均顯著增加;抗病鑒定結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)菌核病的抗性顯著增加,同時(shí)目標(biāo)

8、基因的過表達(dá)不影響植株的正常生長(zhǎng)與發(fā)育。接著以本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的高效、特異(基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和GUS結(jié)果)的油菜花瓣啟動(dòng)子P76247、蘿卜抗菌肽基因Rs以及信號(hào)肽αAmy3SP為基本元件,構(gòu)建載體,轉(zhuǎn)化擬南芥。結(jié)果表明,Rs在花中表達(dá)量最高(相對(duì)于Actin基因表達(dá)量),顯著高于葉和莖,也顯著高于35S驅(qū)動(dòng)的該基因在花、葉和莖中的表達(dá)量。盡管花瓣的抑菌或抗病效果檢測(cè)尚未完成,但基于其在花中的高表達(dá)和35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因抗病性結(jié)果,可預(yù)期

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