稀有人參皂苷compound K的制備和活性研究.pdf

1、人參(Panax ginseng)在我國的應(yīng)用已有數(shù)千年歷史，自古被列為上品，現(xiàn)作為名貴中藥材也已聞名全世界?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參皂苷(ginsenoside)是人參的主要活性成分。人參皂苷compound K(CK)屬二醇型稀有人參皂苷，其在天然的人參中并不存在，是其他二醇型人參皂苷在人腸道內(nèi)的主要降解產(chǎn)物，是真正被吸收和發(fā)揮作用的實體，現(xiàn)已成為人參皂苷研究的新熱點。但是，有關(guān)其制備和體內(nèi)活性的研究還很少，更未見大規(guī)模制備的報道。

2、
　　 本研究在上海-SK研究與發(fā)展基金(2003001-S)，上海市科委重點項目(No.05431927)和復(fù)旦大學(xué)研究生創(chuàng)新基金資助下，從菌種篩選開始，完整地建立了霉菌好氣性發(fā)酵轉(zhuǎn)化二醇型皂苷制備人參皂苷compound K的新方法。并成功把實驗室的研究成果產(chǎn)業(yè)化，建立了中試發(fā)酵和純化工藝，為大規(guī)模生產(chǎn)稀有人參皂苷compound K奠定了扎實的基礎(chǔ)。研究中建立了同時檢測多個轉(zhuǎn)化中間體的HPLC方法，從理論上具體闡述了霉菌生

3、物轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1至CK的主要代謝途徑。報道了CK的晶體結(jié)構(gòu)，并從發(fā)酵液中分離得到了另外2個新化合物和2個已知化合物；在對CK的生物活性進(jìn)行研究時，不僅探討了CK抗腫瘤活性的作用機制；還系統(tǒng)地進(jìn)行了CK抗急性炎癥、佐劑性關(guān)節(jié)炎和Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥效研究，發(fā)現(xiàn)了CK在該方面的新的顯著活性。以上研究結(jié)果均為CK一類新藥開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。具體結(jié)果如下：
　　 1、本研究共從采集到的土樣中分離得到306株霉菌，篩選到了新的

4、高轉(zhuǎn)化菌株P(guān)aecilomyces Bainier sp.229，并進(jìn)行了紫外誘變。
　　 2、本研究采用單因素篩選和正交優(yōu)化相結(jié)合的方法，對碳、氮源，生長因子及金屬離子進(jìn)行了配比優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)基配方，CK克分子轉(zhuǎn)化率從原始培養(yǎng)基的21％提高到了51％左右。并對其它發(fā)酵條件進(jìn)行了考察，通過確定最佳發(fā)酵溫度、pH、發(fā)酵時間、通氣量、接種量、底物投料量及表面活性劑等，使轉(zhuǎn)化率進(jìn)一步提高到72.7％，大大高于文獻(xiàn)報道值。
　

5、　 3、本研究首次建立了發(fā)酵轉(zhuǎn)化過程中，中間代謝產(chǎn)物同時檢測的HPLC分析方法，并通過線性、靈敏度、準(zhǔn)確性以及精密度進(jìn)行了方法驗證。利用該方法進(jìn)行了代謝途徑的研究，結(jié)果表明Paecilomyces Bainier sp.229發(fā)酵轉(zhuǎn)化Rb1生成CK的主要代謝途徑是Rb1→Rd→F2→CK，并首次報道了各個代謝物在轉(zhuǎn)化過程中的變化曲線，為今后繼續(xù)深入進(jìn)行代謝調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 4、為適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)，本研究首次建立了三級發(fā)

6、酵的中試工藝，篩選了一、二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。通過pH調(diào)節(jié)，溶氧-轉(zhuǎn)速關(guān)聯(lián)，以及底物誘導(dǎo)等一系列關(guān)鍵點控制，10 L發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化率最終達(dá)到75.47％，連續(xù)三批50 L中試放大實驗，轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到83.22％。同時本研究建立了適用于中試放大生產(chǎn)的CK純化工藝，總收率達(dá)到65％以上，最終產(chǎn)品的純度可以達(dá)到92％以上。以上研究建立了我國獨特的工業(yè)化生產(chǎn)人參皂苷compound K的新工藝。
　　 5、本研究首次對CK進(jìn)行了X-r

7、ay單晶衍射分析，研究了其晶體學(xué)結(jié)構(gòu)。其A環(huán)和B環(huán)都是高度對稱的椅式構(gòu)象，C環(huán)由于受到C12羥基的拉伸和五元D環(huán)的張力，形成了扭曲的椅式構(gòu)象，而D環(huán)采用13α，14β-半椅式構(gòu)象。為進(jìn)一步進(jìn)行CK構(gòu)效關(guān)系研究提供了重要數(shù)據(jù)。
　　 6、本研究運用常規(guī)硅膠柱分離和半制備高效液相分離相相結(jié)合的方法，從發(fā)酵液中分離到其他2個已知化合物，2個新化合物。經(jīng)ESI-MS，1H、13C-NMR，DEPT，HSQC及HMBC譜分析鑒定，兩個已知

8、化合物分別是PPT和Rh1。兩個新化合物中，NewⅠ是C3位連有羰基的二醇型人參皂苷，NewⅡ則是在側(cè)鏈C25上引入了過氧羥基，雙鍵移到C23-C24位置的二醇型人參皂苷。
　　 7、本研究進(jìn)行了CK體外腫瘤細(xì)胞增殖抑制試驗，結(jié)果顯示其對不同腫瘤細(xì)胞均有較為顯著的增殖抑制作用，并呈明顯的量效關(guān)系。體內(nèi)抗腫瘤藥效試驗結(jié)果表明，CK單獨用藥抑制腫瘤生長的效果一般，但與化療藥物聯(lián)用時具有明顯的增效作用，抑制率可達(dá)66％?？鼓[瘤機制研究

9、表明，CK與CTX聯(lián)用時，可以明顯改善CTX對WBC、IL-2、TNF-γ和胸腺系數(shù)的抑制，CK既可提高化療藥物的藥效，同時可提高機體免疫力，降低化療藥物引起的毒性。
　　 8、本研究考察了CK在抗關(guān)節(jié)炎方面的活性，發(fā)現(xiàn)其對大鼠足趾急性炎癥的抑制率達(dá)到78.23％；對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎預(yù)防作用的抑制率為31.26％，治療作用的抑制率可達(dá)36.15％，均明顯高于消炎痛和雷公藤。對Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎預(yù)防作用，抑制率最高可