脂蛋白脂酶基因突變(C310R-E396V)致家族性高乳糜微粒血癥的分子機制研究.pdf

1、目的：
　　我們在國際上首次發(fā)現(xiàn)兩個全新的脂蛋白酯酶基因的突變C310R（c.T928C）和E396V（c.A1187T）。本課題擬在人體水平和細胞水平上對該突變基因進行功能性和分子機制研究，有助于構(gòu)建我國家族性高乳糜微粒血癥患者的脂蛋白脂酶基因突變型與表型關(guān)系譜。
　　方法：
　　提取先證者全體家族成員的外周血DNA，利用全外顯子測序技術(shù)確定脂蛋白脂酶突變位點，然后通過一代測序進行驗證。體內(nèi)實驗需分別在攜帶脂蛋白脂酶

2、基因突變的患者和正常人體內(nèi)注射肝素（60IU/kg），通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測肝素后血漿中脂蛋白脂酶濃度，酶熒光法檢測脂蛋白脂酶和肝脂酶的活性，非變性膠western blot檢測突變對于LPL二聚體形成的影響。體外實驗構(gòu)建攜帶該突變基因位點的慢病毒表達載體，通過轉(zhuǎn)染COS-1細胞，分別檢測細胞上清和裂解液內(nèi)脂蛋白脂酶的活性和濃度。通過熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)檢測該突變對于基因轉(zhuǎn)錄水平影響。
　　結(jié)果：
　　全外顯子測序結(jié)果顯示

3、先證者馬建華（I-2）的脂蛋白脂酶基因6號外顯子有一個新的T>C的雜合子突變(c.T928C)，該突變導致編碼的半胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?p.C310R)；而馬超（II-1）則攜帶兩個脂蛋白脂肪酶基因復合雜合子突變，其中一個突變位點與馬建華相同，另一個突變位點位于8號外顯子A>T的突變（c.A1187T），該突變使編碼的谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸(p.E396V)。人體水平的研究發(fā)現(xiàn)先證者和 I-1血漿中脂蛋白脂酶的濃度和活性與正常人相比均明顯下降