紅花黃色素對(duì)控制性低血壓誘導(dǎo)的缺血缺氧性腦損傷的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　基于筆者前期研究的關(guān)于控制性降壓不同水平對(duì)海馬CA1區(qū)的影響結(jié)果，發(fā)現(xiàn)將MAP降至基礎(chǔ)值的45％時(shí)，兔海馬CA1神經(jīng)元凋亡程度最嚴(yán)重，而SYP對(duì)兔較低CH水平誘導(dǎo)的缺血缺氧性腦損傷的影響及作用機(jī)制，目前少見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)建立硝普鈉單純性控制性低血壓動(dòng)物模型，觀察紅花黃色素對(duì)缺血缺氧性腦損傷后線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷程度以及缺血損傷相關(guān)蛋白（Caspase-3、nNOS和HIF-1α）表達(dá)的影響，探討低血壓狀態(tài)下SY

2、P對(duì)兔腦海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用以及可能的發(fā)生機(jī)制，為臨床研究提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.動(dòng)物與分組:健康新西蘭白兔40只（雌雄各半，體重1.8～2.2Kg，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），隨機(jī)分為5組，每組8只。正常組（N組），控制性降壓組（即CH組，平均動(dòng)脈壓[MAP]降至基礎(chǔ)值的45％組），SYP預(yù)處理組（SYP1組，控制性降壓基礎(chǔ)值45％前30min靜脈給予SYP，2ml/kg，用生理鹽水配制，含SYP1.6m

3、g/ml），SYP后處理組（SYP2組，控制性降壓基礎(chǔ)值45％開(kāi)始后30min靜脈注射SYP，2ml/kg，用生理鹽水配制，含SYP1.6mg/ml），SYP預(yù)處理+后處理組（SYP1+SYP2組，控制性降壓基礎(chǔ)值45％開(kāi)始前30min和開(kāi)始后30min均給予靜脈注射SYP，2ml/kg，用生理鹽水配制，含SYP1.6mg/ml)。
　　2.模型制作:本研究沿用筆者前期的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行控制性降壓模型的制作，具體操作步驟

4、如下:將禁飲禁食12h的實(shí)驗(yàn)兔用水合氯醛腹腔注射麻醉后，在兔臺(tái)上固定頭與四肢。剃除頸前部兔毛，消毒，行氣管切開(kāi)插氣管導(dǎo)管并接動(dòng)物呼吸機(jī)機(jī)械通氣（潮氣量21ml，呼吸51 bpm，F(xiàn)iO21.0）。分離右側(cè)頸內(nèi)靜脈、穿刺置管，接延長(zhǎng)管輸液通路并輸液。左側(cè)腹股溝四周剪毛，消毒，于腹股溝下緣靠?jī)?nèi)測(cè)分離股動(dòng)脈并穿刺置管，接測(cè)壓轉(zhuǎn)換器通路行平均動(dòng)脈測(cè)壓。操作結(jié)束，無(wú)菌濕紗布覆蓋傷口，輸注適量乳酸鈉林格氏液，補(bǔ)充禁食喪失的液體總量約15ml/kg;

5、將兔臺(tái)平放于39.5℃恒溫毯上保溫。待血壓穩(wěn)定15min后，記錄此刻基礎(chǔ)的平均動(dòng)脈壓(MAP)、心率(HR)、中心靜脈壓(CVP)。正常組采用5％葡萄糖注射液4ml/(kg.h)連續(xù)泵注;降壓組及治療組均采用5％葡萄糖液配制的硝普鈉(400ug/ml)開(kāi)始泵注，10～15分鐘內(nèi)降至目標(biāo)血壓，通過(guò)間斷的調(diào)節(jié)泵速，維持目標(biāo)血壓1h。根據(jù)上述分組方案，在對(duì)應(yīng)的時(shí)間給予紅花黃色素。降壓期間所有動(dòng)物的補(bǔ)液量（包括降壓藥物液體量），依據(jù)CVP調(diào)整，

6、盡量減少補(bǔ)液量對(duì)血容量的影響。降壓完畢后，各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用乳酸鈉林格氏液4ml/(kg·h)泵速再灌注2h后處死。取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物海馬CA1區(qū)神經(jīng)元組織行病理學(xué)檢查，采用透射電鏡觀察線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)改變，TUNEL法染色觀察腦組織標(biāo)本的細(xì)胞凋亡情況，使用免疫組化及Western blot檢測(cè)海馬組織中nNOS、HIF-1α、以及Caspase-3蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.所有動(dòng)物模型均制作成功，未出現(xiàn)因麻醉或手術(shù)意外的死亡。正常

7、組死亡率為0，CH組死亡6只:2只死于降壓45min后，其余4只死于復(fù)壓開(kāi)始后，死亡率75％; SYP1、SYP2、SYP1+SYP2組的動(dòng)物分別死亡1只、2只、1只，均陸續(xù)死于復(fù)壓1h后，其死亡率均低于CH組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　2.透射電鏡下觀察海馬CA1區(qū)線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)及Flameng評(píng)分:N組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞器清晰可見(jiàn)，核仁染色質(zhì)均勻，未見(jiàn)核固縮碎裂或溶解;CH組可見(jiàn)超微結(jié)構(gòu)損傷較嚴(yán)重，可見(jiàn)核碎裂、溶解，

8、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)基本被破壞;SYP1組、SYP2組、SYP1+SYP2組損傷較CH組有所減輕，未見(jiàn)明顯的核碎裂及溶解，細(xì)胞間連接緊密;CH組線(xiàn)粒體Flameng評(píng)分較其他組均高(P＜0.05)，其余各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.TUNEL染色觀察凋亡細(xì)胞、計(jì)算凋亡指數(shù):N組細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，可見(jiàn)極少量TUNEL陽(yáng)性染色細(xì)胞;CH組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著增多;紅花黃色素處理組（SYP1組、SYP2組、SYP1+SYP2組）T

9、UNEL陽(yáng)性染色細(xì)胞較CH組顯著減少(P＜0.05);但SYP2組凋亡細(xì)胞數(shù)較其他兩組（SYP1組、SYP1+SYP2組）多，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.免疫組化和Western blot檢測(cè)海馬CA1區(qū)nNOS、HIF-1α、Caspase-3蛋白的表達(dá):與N組相比，CH組nNOS、HIF-1α、Caspase-3表達(dá)顯著增加;紅花黃色素處理組（SYP1組、SYP2組、SYP1+SYP2組）較CH組表達(dá)下降，SY

10、P2組與其他兩組比較各蛋白含量有所增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.通過(guò)形態(tài)學(xué)等研究證實(shí)紅花黃色素對(duì)控制性低血壓誘導(dǎo)的腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，在一定程度上可能降低其死亡率;
　　2.在腦缺血再灌注損傷中，紅花黃色素起到保護(hù)作用可能與減少nNOS和HIF-1α的含量有關(guān);
　　3.紅花黃色素通過(guò)抑制Caspase-3蛋白的表達(dá)，減少細(xì)胞的凋亡，從而抑制腦缺血再灌注損傷中神經(jīng)元的凋亡