羥基紅花黃色素A促大鼠局灶性腦缺血后血管新生作用的分子基礎(chǔ)初探.pdf

1、目的： 促腦卒中后的血管新生治療是近年來抗腦缺血藥物研究的熱點(diǎn)之一。羥基紅花黃色素A(hydroxysaffior yellow A，HSYA)是傳統(tǒng)活血化瘀中藥紅花的主要活性成分之一。我們前期研究結(jié)果提示HSYA可能通過促進(jìn)血管新生而發(fā)揮腦保護(hù)作用，本研究旨在對(duì)其促腦缺血后血管新生的早期分子基礎(chǔ)做初步探討。 方法： 1. 建立線栓法致大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(Middle cerebral artery occlus

2、ion，MCAO)模型，設(shè)缺血后6h、12h、24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分為假手術(shù)組(n=8)、模型組(n=8)、陽性對(duì)照藥組(MK801 0.5mg/kg，n=8)和HSYA治療組(60mg/kg，n=8)。缺血后即刻舌下靜脈給藥，HSYA組以一個(gè)半衰期(30min)為間隔連續(xù)給藥5次(每次12mg/kg)，總給藥劑量60mg/kg。于腦缺血后6h、12h和24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別觀察HSYA對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)行為障礙和MCAO大鼠腦梗死

3、體積的影響。 2．以MCAO大鼠為模型，設(shè)缺血后1.5h、3h、6h、12h、24h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分為假手術(shù)組、模型組和HSYA治療組(n=3)，給藥方法同上。選用包括與血管新生密切相關(guān)的生長因子、生長因子受體、黏附分子、轉(zhuǎn)錄因子等113個(gè)基因的血管生成功能分類基因芯片，檢測HSYA在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠缺血側(cè)皮層半暗帶中血管新生相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。使用綜合型GEArray表達(dá)分析配套軟件進(jìn)行完整的芯片數(shù)據(jù)分析。

4、 3．在分析基因芯片結(jié)果的基礎(chǔ)上，應(yīng)用RT-PCR法觀察HSYA對(duì)線栓法致急性腦缺血后1.5h、3h、6h、12h、24h缺血側(cè)皮層半暗帶中HIF-1α、VEGF、Flt、bFGF、aFGF五個(gè)血管新生密切相關(guān)基因的mRNA表達(dá)的影響，以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果采用圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。同時(shí)采用實(shí)時(shí)定量PCR法分析HSYA對(duì)大鼠急性腦缺血后3h、24h缺血側(cè)皮層半暗帶中HIF-1α、VEGFmRNA表達(dá)的影響。以GAPDH為內(nèi)參，獲

5、得HIF-1α、VEGF mRNA的相對(duì)含量做組間比較。 4．采用Western Blotting法分別觀察HSYA對(duì)線栓法致急性腦缺血后1.5h、3h、6h、12h、24h缺血側(cè)皮層半暗帶中HIF-1α、VEGF、Fit、bFGF、aFGF蛋白表達(dá)的影響，以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果采用圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。 結(jié)果： 1. 與假手術(shù)組相比，缺血后6h、12h和24h，模型組大鼠神經(jīng)行為障礙明顯，腦梗死體積顯著

6、增加，陽性對(duì)照藥MK801靜脈給藥明顯改善腦缺血?jiǎng)游锷窠?jīng)癥狀，減小腦梗死體積(P<0.05)；HSYA給藥組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物神經(jīng)行為癥狀均得到明顯改善，腦梗死體積顯著減小(P<0.05)。 2．基因芯片結(jié)果提示，與假手術(shù)組比較，缺血24小時(shí)內(nèi)：MCAO模型組有75個(gè)基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，其中19個(gè)顯著上調(diào)，56個(gè)顯著下調(diào)；大部分血管新生激活基因(如缺氧誘導(dǎo)因子、酸性成纖維生長因子、表皮生長因子、胰島素樣生長因子等)在缺血后有不同程

7、度的表達(dá)下調(diào)；IL-1β、MCP-1等炎癥和趨化因子基因持續(xù)上調(diào)；抗炎細(xì)胞因子IL-10在缺血后3h和24h顯著下調(diào)。而HSYA給藥組，有85個(gè)發(fā)生顯著變化，其中58個(gè)顯著上調(diào)，27個(gè)顯著下調(diào)。上調(diào)最為明顯的是血管新生誘導(dǎo)因子基因(如HIF．1α、VEGF、aFGF、Ang2等)和炎癥相關(guān)因子基因(如IL-6、IL1β、IL-10等)；下調(diào)的有凝血酶敏感素等基因。 3. RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果綜合顯示，與假手術(shù)組比較，

8、缺血后3小時(shí)模型組腦皮層半暗帶的VEGF、HIF-1α、Flt、bFGF基因表達(dá)有顯著下調(diào)(P<0.05)，而HSYA可使aFGF、bFGF、Flt、HIF-1αmRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；缺血后24h，在模型組中HIF-1α、Flt mRNA表達(dá)上調(diào)的基礎(chǔ)上，HSYA可使bFGF、VFGF mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)。 4．蛋白免疫印跡研究顯示，MCAO后24h內(nèi)，HSYA可先后使缺血側(cè)腦皮層半暗帶HIF-

9、lα、Flt、aFGF、bFGF蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，與模型組比較有顯著差異(P<0.05)，其上調(diào)作用具有不同的時(shí)相性。HSYA可上調(diào)VEGF的蛋白表達(dá)，但與模型組比較未見顯著差異。 結(jié)論： 基因芯片結(jié)果提示內(nèi)源性的促血管新生相關(guān)基因的表達(dá)在腦缺血后24h內(nèi)經(jīng)歷了一個(gè)先下降后上調(diào)的動(dòng)態(tài)過程，同時(shí)提示HSYA促血管新生早期的分子作用機(jī)制是一個(gè)多因子多通路參與的網(wǎng)絡(luò)化過程，其中對(duì)血管新生相關(guān)基因(如HIF-1α、VEGF、a