福建省丙型肝炎流行特征及體外細(xì)胞培養(yǎng)模型的構(gòu)建與應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　 近年疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)直報(bào)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)丙型肝炎報(bào)告病例數(shù)呈遞增態(tài)勢(shì)，而丙型肝炎感染后癥狀的隱匿性使其易發(fā)展成慢性肝炎、肝硬化甚至是肝細(xì)胞癌，丙型肝炎已經(jīng)成為重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。我國(guó)關(guān)于丙型肝炎流行病學(xué)、病原學(xué)方面的研究較少，而福建省僅在1992年進(jìn)行過(guò)自然人群丙型肝炎抗體陽(yáng)性率的調(diào)查，此后未見(jiàn)大規(guī)模的流行病學(xué)研究，也未見(jiàn)報(bào)道福建省丙型肝炎病毒基因型的分布特征。另外，不同基因型間對(duì)抗病毒藥物的敏感性不同，而丙型肝炎病毒體

2、外培養(yǎng)模型的缺乏使其在致病機(jī)制、疫苗研究、藥物篩選等方面的研究長(zhǎng)期停滯不前。因此，為了更好地預(yù)防和控制丙型肝炎，非常有必要對(duì)福建省丙型肝炎的流行特征進(jìn)行分析，獲取丙型肝炎流行現(xiàn)狀的基礎(chǔ)資料，建立丙型肝炎報(bào)告數(shù)的預(yù)測(cè)模型，為丙型肝炎防治策略的制定提供數(shù)據(jù)支持；此外，建立福建省丙型肝炎流行基因型病毒株的體外培養(yǎng)模型，為丙型肝炎基礎(chǔ)研究提供平臺(tái)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行藥物篩查等工作，從實(shí)踐意義上指導(dǎo)丙型肝炎臨床用藥。
　　 方法：
　　

3、 1、采用多階段抽樣的方法，通過(guò)橫斷面調(diào)查研究，獲取丙型肝炎流行現(xiàn)狀的基礎(chǔ)資料；應(yīng)用間接ELISA方法檢測(cè)血清中的丙型肝炎病毒抗體，分析2006年福建省自然人群抗-HCV陽(yáng)性率；
　　 2、通過(guò)收集無(wú)償獻(xiàn)血者、吸毒者以及醫(yī)院來(lái)源的抗-HCV陽(yáng)性的血清標(biāo)本，采用RT-PCR方法，分別進(jìn)行C/E1區(qū)和NS5B區(qū)基因的擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，應(yīng)用生物學(xué)軟件對(duì)序列進(jìn)行分析比較，構(gòu)建序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析福建省不同人群間基因分布的特征；

4、>　　 3、根據(jù)《中國(guó)疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)》疫情數(shù)據(jù)庫(kù)中福建省2004～2010年HCV的月報(bào)發(fā)病數(shù)據(jù)，分析其數(shù)據(jù)特征，建立最優(yōu)的發(fā)病預(yù)測(cè)模型；
　　 4、應(yīng)用長(zhǎng)片段核酸擴(kuò)增和基因克隆技術(shù)，獲取不同亞型HCV基因組的全長(zhǎng)序列，構(gòu)建重組質(zhì)粒；將福建流行株全長(zhǎng)基因與JFH1株的非編碼區(qū)進(jìn)行嵌合，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄、Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染，構(gòu)建不同亞型嵌合的體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，經(jīng)IFA、RT-PCR等方法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證鑒定，并初步將該模型用于體外藥物

5、篩選。
　　 結(jié)果：
　　 1、福建省自然人群抗-HCV陽(yáng)性率為0.7％，地區(qū)分布無(wú)差異，男女無(wú)差異，隨著年齡增長(zhǎng)，抗-HCV陽(yáng)性率有增加趨勢(shì)，尤其是50歲以上年齡組，抗-HCV陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于50歲以下年齡組；雖然1992年人群抗-HCV陽(yáng)性率的調(diào)查存在假陽(yáng)性率等問(wèn)題，結(jié)合其他資料，可以認(rèn)為人群抗-HCV陽(yáng)性率呈下降趨勢(shì)，但HCV防治形勢(shì)不容樂(lè)觀；
　　 2、福建省丙型肝炎主要流行基因型為6a和1b，其次為3b和2

6、a，不同人群間流行基因型有差別，臨床病例的主要流行基因型為1b，而無(wú)償獻(xiàn)血者和吸毒者主要流行基因型為6a，從不同人群間流行基因型分布的差異可以推論，可能存在主要流行基因型由1b向6a轉(zhuǎn)變的情況；還發(fā)現(xiàn)可能存在混合感染的情況，主要表現(xiàn)為3b亞型與其他型別的重組；
　　 3、《中國(guó)疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)》疾病監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，自2004年實(shí)行網(wǎng)絡(luò)直報(bào)后，丙型肝炎報(bào)告數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)，且報(bào)告數(shù)的上升是由臨床診斷病例數(shù)上升引起的，實(shí)驗(yàn)室確診病

7、例數(shù)基本保持穩(wěn)定，臨床診斷病例數(shù)的上升可能有幾個(gè)方面原因：責(zé)任人報(bào)告意識(shí)增強(qiáng)、感染者發(fā)展為病人、報(bào)告人掌握的HCV診斷標(biāo)準(zhǔn)不嚴(yán)謹(jǐn)；
　　 4、建立的ARIMA(2,1,0)(2,1,0)12(無(wú)常數(shù))模型對(duì)丙型肝炎月報(bào)數(shù)進(jìn)行了較好的跟蹤與預(yù)測(cè)，但由于外界其他因素變化的影響，用于中短期預(yù)測(cè)效果優(yōu)于長(zhǎng)期預(yù)測(cè)。
　　 5、擴(kuò)增并拼接了6株不同亞型的丙型肝炎病毒全長(zhǎng)基因（其中1b亞型兩株，3a、3b、6a及6n亞型各一株）以及1

8、a亞型半長(zhǎng)片段；構(gòu)建了全長(zhǎng)重組質(zhì)粒pBS1、pBR2、pBSR5、pXX4、pXX19及pXQ124；
　　 6、成功構(gòu)建了pBS1/JFH1（6a/2a）嵌合體外細(xì)胞培養(yǎng)模型。pBS1/JFH1經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的感染性RNA轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后產(chǎn)生的衍生病毒可以引起新的Huh7細(xì)胞的感染，與pJFH1相比，構(gòu)建的嵌合株感染力相對(duì)較弱；
　　 7、將構(gòu)建的pBS1/JFH1（6a/2a）嵌合體外細(xì)胞培養(yǎng)模型初步應(yīng)用于藥物篩選

9、。研究結(jié)果表明INFα能有效抑制病毒復(fù)制，而且這種抑制呈劑量依賴性，RBV、NTZ和CsA單獨(dú)應(yīng)用也都能抑制HCV病毒的復(fù)制，但需要較大劑量，而這三種藥物與INFα聯(lián)合應(yīng)用，都能顯著提高INFα的抗病毒作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、福建省自然人群抗-HCV陽(yáng)性率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但由于受HCV易慢性化特點(diǎn)的影響，使多年前HCV較高的陽(yáng)性率表現(xiàn)為目前發(fā)病率的逐年增加。
　　 2、完成福建省不同人群HCV基因流行型分析