Nrf2通過調(diào)控Trx1-TXNIP復合物抑制腦缺血再灌注損傷后NLRP3炎性復合體的活化.pdf

1、背景：
　　NLRP3（NOD-like receptor pyrin domain containing three）為胞漿內(nèi)模式識別受體NOD樣受體家族當中的一員；NLRP3在應激狀態(tài)下可以發(fā)生自身寡聚化，在凋亡相關微粒蛋白ASC（apoptosis—associated speck-like protein containing）幫助下募集pro-caspase1形成NLRP3炎性復合體。既往研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性復合體的活

2、化在缺血再灌注損傷當中起到重要的作用，但至今上游的調(diào)控機制尚未明確，因此，尋找能夠抑制NLRP3炎性復合體活化的負性調(diào)控因子并闡明其調(diào)控的機制具有重要意義。
　　目的：
　　探討在大鼠腦缺血再灌注損傷中Nrf2能否通過調(diào)控Trx1/TXNIP復合物抑制NLRP3炎性復合體的活化及其作用機制
　　方法：
　?。?）運用Longa線栓法對SD大鼠進行大腦中動脈栓塞（Middle Cerebral Artery Occ

3、lusion,MCAO）模型的建立。篩選在腦缺血再灌注損傷后NLRP3表達最高時間點：分別于模型建立后4h、8h、12h、24h、48h進行麻醉、生理鹽水灌注、斷頭后取腦，腦組織用于之后的Western blot分析。
　?。?）合成特異性 NLRP3 siRNA(NLRP3_1980、NLRP3_2185、NLRP3_2262)與用于對照組的 control siRNA,并于 MCAO模型建立前24h進行siRNA的側腦室注射，

4、利用Western blot篩選出干擾效果最佳的NLRP3 siRNA片段。
　　（3）利用Western blot對Sham、MCAO、MCAO+control siRNA、MCAO+NLRP3 siRNA組檢測NRLP3炎性復合體的表達，與其下游的炎性因子IL-1β與IL-18與Caspase-1的表達，觀察各組中建模后神經(jīng)功能學評分，利用TTC染色檢測大鼠腦梗死體積，并使用ELISA法檢測IL-18、IL-1β的蛋白濃度。<

5、br>　　（4）合成特異性Trx1 siRNA建立Trx1干擾的大鼠MCAO模型，利用RT-qPCR與Western Blot驗證其干擾效果，并使用Western blot檢測Sham、MCAO、MCAO+control siRNA、MCAO+Trx1 siRNA各組中Trx1、NLRP3炎性復合體與胞漿、胞核中TXNIP的表達。
　?。?）合成特異性Nrf2 siRNA進行Nrf2干擾的大鼠MCAO模型的建立，并使用tBHQ誘導

6、Nrf2激活的大鼠MCAO模型，將tBHQ溶于二甲亞砜（DMSO），tBHQ在建模前24h進行第一次腹腔注射，共三次，每次間隔8h，使用Western blot與RT-qPCR進行Nrf2干擾與激活效果的驗證，并檢測Sham、MCAO、MCAO+DMSO、MCAO+tBHQ、MCAO+control siRNA、MCAO+NLRP3 siRNA組中，Nrf2、NLRP3、Caspase-1以及炎性因子IL-1β、IL-18的表達，并用E

7、LISA法檢測IL-β、IL-18蛋白濃度。
　　（6）建立Trx1干擾的tBHQ激活Nrf2的大鼠MCAO模型，在Sham、MCAO、MCAO+DMSO、MCAO+tBHQ、MCAO+control siRNA、MCAO+Nrf2 siRNA、MCAO+tBHQ+Trx1 siRNA組中利用Western Blot檢測TXNIP在胞漿以及胞核當中的表達。
　　結果：
　?。?）NLRP3炎性復合體的表達在I/R損傷后

8、于24小時達到頂峰，之后至48小時呈現(xiàn)出下降的趨勢。
　?。?）在特異性干擾片段中，NLRP3_2185干擾效果最明顯，達65%以上。
　?。?）MCAO與MCAO+control siRNA組相比無干擾效果，且兩組與MCAO+NLRP3 siRNA相比，干擾NLRP3后，Caspase-1表達下降，下游炎癥因子IL-18與IL-1β表達減少，腦梗死體積明顯減小，行為學缺損也有所改善。
　?。?）MCAO+Trx1 s

9、iRNA組與MCAO組相比之下，Trx1干擾組中NLRP3炎性復合體表達有所上升，胞核當中 TXNIP表達減少，胞漿當中TXNIP表達上升。
　?。?）MCAO+DMSO組與MCAO組相比較下Nrf2表達無統(tǒng)計學差異，MCAO+DMSO組與MCAO+tBHQ組相比較下，Nrf2在后者組中表達量明顯上升，除胞核當中TXNIP表達有所上升外，NLRP3炎性復合體、胞漿中TXNIP、Caspase-1、IL-18、IL-1β表達量明顯下

10、降，反之，MCAO+Nrf2 siRNA與MCAO+control siRNA相比下，Nrf2干擾片段可明顯降低Nrf2表達，且除胞核當中TXNIP表達有所下降外，NLRP3炎性復合體、胞漿當中TXNIP、Caspase-1、IL-18、IL-1β表達量明顯上升。另外，MCAO+tBHQ+Trx1 siRNA組與MCAO+tBHQ組相比下，干擾Trx1的Nrf2激動組中TXNIP在胞漿當中的表達明顯升高，且在胞核當中的表達明顯下降。