TLR4信號(hào)途經(jīng)對(duì)重癥急性胰腺炎Treg-Thl7平衡的影響及大黃素治療作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　檢測(cè)重癥急性胰腺炎（SAP）病程中Treg／Th17平衡變化和Toll樣受體4（TLR4）信號(hào)通路對(duì)SAP病生理過(guò)程的影響，以及大黃素的治療效應(yīng)。分析TLR4信號(hào)通路是否可通過(guò)影響Treg／Th17平衡，參與SAP發(fā)生發(fā)展，以及大黃素發(fā)揮效應(yīng)的作用機(jī)制，深化對(duì)SAP病理生理機(jī)制的認(rèn)識(shí)。
　　方法：
　　1、TLR4信號(hào)通路在SAP病生理機(jī)制中的作用:SPF級(jí)健康雄性C57/BL小鼠40只,TLR4基因敲除小

2、鼠40只，體重均約20g，隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組（n=20）:(1)對(duì)照組(Sham組)；(2)重癥急性胰腺炎模型組（SAP組）;(3) TLR4-對(duì)照組(TLR4-Sham組)；(4) TLR4-重癥急性胰腺炎模型組（TLR4-SAP組）。2、大黃素治療SAP機(jī)制研究:SPF級(jí)健康雄性C57/BL小鼠60只,體重約20g，隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組（n=20）:(1)對(duì)照組(Sham組)；(2)重癥急性胰腺炎模型組（SAP組）；(3)

3、大黃素治療組（Emodin組）。受試動(dòng)物喂養(yǎng)于室溫約為（20-25）℃的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中，正常飼養(yǎng)一周，實(shí)驗(yàn)前禁食18 h，可自由飲水。采用雨蛙素聯(lián)合脂多糖小鼠腹腔內(nèi)給藥的方法制備小鼠SAP模型。大黃素治療組于制作SAP模型后經(jīng)腹腔緩慢注射大黃素2.5mg/kg體重。觀(guān)察術(shù)后48小時(shí)內(nèi)各組小鼠死亡率，斷頸處死小鼠，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平。HE染色方法檢測(cè)胰腺組織病理學(xué)改變，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清中T

4、NF-α、IL-6、IL-10水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠Treg及Th17比例,實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)Foxp3 mRNA、RORγt mRNA、IL-17mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、TLR4信號(hào)通路在SAP病生理機(jī)制中的作用
　　1.1.Sham組及TLR4-Sham組小鼠腹腔注射生理鹽水后僅有部分出現(xiàn)活動(dòng)減少，其余小鼠呼吸平穩(wěn)，活動(dòng)及飲水均正常，大便成形，顏色為棕黑色，對(duì)外界刺激反應(yīng)正常。SAP組小

5、鼠在注射雨蛙素及脂多糖后，即出現(xiàn)呼吸頻率增快、被毛凌亂且無(wú)光澤、活動(dòng)倦怠、進(jìn)食水減少、對(duì)外界刺激反應(yīng)淡漠等癥狀，部分小鼠甚至出現(xiàn)腹瀉癥狀。TLR4-SAP組小鼠造模后表現(xiàn)出活動(dòng)減少，呼吸增快，飲水正常，被毛略顯凌亂但有光澤，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲緩，未出現(xiàn)腹瀉癥狀，一般狀態(tài)較SAP組好轉(zhuǎn)。
　　1.2.Sham組及TLR4-Sham組48h內(nèi)小鼠無(wú)死亡，死亡率為0％。SAP組12h、24h、48h累積死亡率分別為5%、10%、20%。T

6、LR4-SAP組12h、24h、48h累積死亡率分別為0%、5%、10%。SAP組48h內(nèi)累積死亡率較Sham組明顯升高（P<0.05），而TLR4-SAP組較SAP組明顯下降（P<0.05）。
　　1.3.Sham組及TLR4-Sham組血清脂肪酶、血清淀粉酶水平比較無(wú)明顯差異（P>0.05）。SAP模型組血清脂肪酶、血清淀粉酶明顯高于Sham組（P<0.05），胰腺病理?yè)p害明顯，組織學(xué)評(píng)分升高（P<0.05）；TLR4-SAP

7、組較SAP組血清脂肪酶、血清淀粉酶均下降（P<0.05），同時(shí)胰腺病理?yè)p害減輕，組織學(xué)評(píng)分下降（P<0.05）。
　　1.4.Sham組及TLR4-Sham組血清中TNF-α、IL-6、IL-10水平比較無(wú)明顯差異（P>0.05）。SAP組血清中TNF-α、IL-6、IL-10水平顯著高于Sham組（P<0.05）。而TLR4-SAP組以上血清因子指標(biāo)較SAP組明顯下降（P<0.05）。
　　1.5.Sham組及TLR4-S

8、ham組比較無(wú)明顯差異（P>0.05）。與Sham組比較，SAP組Treg及Th17細(xì)胞比例均升高（P<0.05），且趨于Th17細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，故Treg/Th17比值降低（P<0.05），于此同時(shí)Foxp3 mRNA、RORγt mRNA、IL-17mRNA表達(dá)均增加（P<0.05）。而TLR4-SAP組Treg及Th17細(xì)胞比例較SAP模型組均降低（P<0.05），以Th17細(xì)胞尤為顯著，所以Treg/Th17比值升高（P<0.05）

9、，并且Foxp3 mRNA、RORγt mRNA、IL-17mRNA表達(dá)均下調(diào)（P<0.05）。
　　2、大黃素治療SAP機(jī)制研究
　　2.1.Sham組小鼠腹腔注射生理鹽水后僅有部分出現(xiàn)活動(dòng)減少，其余小鼠呼吸平穩(wěn)，活動(dòng)及飲水均正常，大便成形，顏色為棕黑色，對(duì)外界刺激反應(yīng)正常。SAP組小鼠在注射雨蛙素及脂多糖后，即出現(xiàn)呼吸急促、被毛凌亂且無(wú)光澤、活動(dòng)倦怠、進(jìn)食水減少、對(duì)外界刺激反應(yīng)淡漠等癥狀，部分小鼠甚至出現(xiàn)腹瀉癥狀。Emo

10、din組小鼠造模后表現(xiàn)出活動(dòng)明顯減少，呼吸增快，被毛豎立無(wú)光澤，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲緩，24h后較SAP組小鼠一般狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)。
　　2.2.Sham組48h內(nèi)小鼠無(wú)死亡，死亡率為0%。SAP組12h、24h、48h累積死亡率分別為5%、10%、20%。Emodin組12h、24h、48h累積死亡率分別為0%、0%、10%。SAP組48h內(nèi)累積較Sham組明顯升高（P<0.05），而Emodin組較SAP組明顯下降（P<0.05）。<

11、br>　　2.3.SAP模型組血清脂肪酶、血清淀粉酶明顯高于Sham組（P<0.05），胰腺病理?yè)p害明顯，組織學(xué)評(píng)分升高（P<0.05）；Emodin組較SAP組血清脂肪酶、血清淀粉酶均下降（P<0.05），同時(shí)胰腺病理?yè)p害減輕，組織學(xué)評(píng)分下降（P<0.05）。
　　2.4.SAP組血清中TNF-α、IL-6、IL-10水平高于Sham組（P<0.05）。而Emodin組血清中TNF-α、IL-6、IL-10水平較SAP組明顯降低

12、（P<0.05）。
　　2.5.SAP組Treg及Th17細(xì)胞比例較Sham組均升高（P<0.05），趨于Th17細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，故Treg/Th17比值降低（P<0.05），于此同時(shí)Foxp3 mRNA、RORγt mRNA、IL-17mRNA表達(dá)均增加（P<0.05）。而Emodin組Treg及Th17細(xì)胞比值較SAP模型組均降低（P<0.05），以Th17細(xì)胞尤為顯著，Treg/Th17比值升高（P<0.05），并且Foxp3

13、mRNA、RORγt mRNA、IL-17mRNA表達(dá)減弱（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、SAP病生理過(guò)程中Treg與Th17細(xì)胞比例及功能活性升高，且以Th17細(xì)胞尤為顯著，導(dǎo)致Treg/Th17失衡，引發(fā)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-10及血清淀粉酶、脂肪酶水平升高，加重了胰腺病理?yè)p害，提高了小鼠的死亡率，從而Treg/Th17失衡可能是導(dǎo)致機(jī)體免疫平衡紊亂，加重SAP嚴(yán)重程度的重要原因之一。
　　2