虎眼萬(wàn)年青總皂苷對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬及凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　虎眼萬(wàn)年青具有顯著的抗腫瘤活性，其皂苷類(lèi)化合物是主要有效成分之一，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谘芯炕⒀廴f(wàn)年青鱗莖和葉各自總皂苷對(duì)結(jié)腸癌的抗癌活性，觀察其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡、自噬的影響，以初步探討抗結(jié)腸癌的作用機(jī)理以及尋找發(fā)現(xiàn)新的有效藥用部位。
　　方法:
　　1.結(jié)腸癌裸鼠模型的制備、標(biāo)本收集與相關(guān)指標(biāo)測(cè)定;藥物虎眼萬(wàn)年青總皂苷(OCA-TS)的提取。
　　(1)制備模型、收集標(biāo)本:每只裸鼠腋窩皮下接種為1×107/

2、0.1ml混懸腫瘤細(xì)胞0.1ml。當(dāng)裸鼠腫瘤體積達(dá)到100mm3時(shí)，認(rèn)為荷瘤成功，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為5組:模型組、陽(yáng)性藥組、OCA-TS組。根據(jù)分組分別進(jìn)行藥物灌胃處理，每天1次。藥物處理7d后處死各組荷瘤裸鼠，收集各組裸鼠血清樣本;取腫瘤組織及癌旁組織。腫瘤組織和癌旁組織部分10％中性甲醛溶液固定，部分液氮速凍轉(zhuǎn)至-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　(2)用HE染色觀察虎眼萬(wàn)年青總皂苷對(duì)腫瘤組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)的影響;Western blot

3、法檢測(cè)腫瘤組織中ATG5、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclinl、VDAC1的表達(dá)量;免疫組化法檢測(cè)VDAC1表達(dá)
　　(3)采用乙醇熱回流法提取虎眼萬(wàn)年青鱗莖和葉中各自總皂苷(TS)成分。
　　2.虎眼萬(wàn)年青總皂苷對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系生長(zhǎng)增殖、凋亡與自噬影響的檢測(cè):
　　(1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè):MTT比色法檢測(cè)OCA-TS鱗莖和葉分別對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響;平板克隆形成實(shí)驗(yàn)(PCF)檢測(cè)OCA-TS對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo的克隆形成能力;

4、Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)OCA-TS對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系凋亡與周期的影響。
　　(2)Western Blotting法檢測(cè)OCA-TS作用人結(jié)腸癌細(xì)胞后凋亡及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況;透射電鏡下觀察OCA-TS對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響以及觀察自噬溶酶體的形成;用Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒追蹤OCA-TS作用人結(jié)腸癌細(xì)胞后產(chǎn)生的自噬流的變化
　　結(jié)果:
　　1.OCA-TS

5、組用0.1g/kg、1g/kg、10g/kg每日灌胃給藥1次，各組連續(xù)給藥7天，對(duì)裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)均具有抑制作用，10g/kgOCA-TS組腫瘤體積抑制率己接近陽(yáng)性藥組的54.95％;HE染色結(jié)果顯示給藥組細(xì)胞細(xì)胞核分裂明顯減少，活躍度降低;Western-blotting結(jié)果顯示:各組用藥小鼠腫瘤組織中均有ATG5、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1等自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，且呈上調(diào)趨勢(shì);免疫組化結(jié)果，用藥組VDAC-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)染色棕

6、黃色、棕褐色顆粒。
　　2.(1)MTT結(jié)果顯示虎眼萬(wàn)年青鱗莖和葉分別提取出的OCA-TS均能夠抑制四種結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)出時(shí)間濃度的依賴(lài)，OCA-TS葉作用48h，IC50分別為:RKO,1.28mg/ml;Caco-2,096mg/ml;HCT116,0.96mg/ml;LoVo,096mg/ml;OCA-TS鱗莖作用48h，IC50分別為:RKO，1.17mg/ml;Caco-2，1.00mg/ml;HCT116，0.

7、97mg/ml;LoVo，0.64mg/ml。OCA-TS鱗莖作用活性稍高于葉，LoVo細(xì)胞對(duì)藥物作用更為敏感。LoVo細(xì)胞在OCA—TS作用以后，各組細(xì)胞克隆形成率明顯下降，與MTT結(jié)果一致，也具有濃度依賴(lài)性。(2)OCA-TS誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡，尤其早期凋亡明顯，1mg/mlOCA-TS用藥組，總凋亡率接近50％(P＜0.01);檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)得到，藥物作用后的LoVo細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降明顯，而促凋亡蛋白Ba

8、x表達(dá)則上調(diào)。(3)OCA-TS使LoVo細(xì)胞周期阻滯于G1期。(4)電鏡下觀察到在Img/mlOCA-TS用藥組自噬溶酶體和自噬空泡的形成;LC3B腺病毒感染用藥細(xì)胞后觀察到自噬流的形成。
　　結(jié)論:
　　1.OCA-TS能夠抑制裸鼠結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移模型動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)2.細(xì)胞水平上，OCA-TS鱗莖和葉對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO細(xì)胞、Caco-2細(xì)胞、HCT116細(xì)胞以及LoVo細(xì)胞均具有明顯的抑制細(xì)胞增殖的作用，說(shuō)明虎眼萬(wàn)年青鱗