虎眼萬年青總皂苷對乳腺癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　 本課題根據(jù)“癌毒學(xué)說”，旨在研究虎眼萬年青總皂苷對乳腺癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響，對細(xì)胞MAPK信號通路蛋白及凋亡相關(guān)蛋白與基因的表達(dá)調(diào)控作用，以初步探討虎眼萬年青抗乳腺癌的有效分子作用機(jī)制。
　　 研究意義：
　　 為抗癌毒新藥的進(jìn)一步研發(fā)及抗癌解毒治則的合理應(yīng)用提供必要的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1、采用MTT比色法檢測ORS對ER(+)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞與E

2、R（—）人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞體外增殖的抑制效應(yīng)，篩選出敏感細(xì)胞、各自的有效作用劑量和有效作用時(shí)間，并判定效量、時(shí)效關(guān)系；
　　 2、倒置顯微鏡觀察25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、400μg/mLORS作用于ER(+)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞與ER（—）人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞48h后對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響；透射電鏡觀察100μg/mLORS作用于人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞48h后，細(xì)胞形態(tài)、

3、結(jié)構(gòu)的變化，以及是否出現(xiàn)核質(zhì)濃縮，凋亡小體、染色質(zhì)邊集等現(xiàn)象；
　　 3、AnnexinV-FITC染色流式細(xì)胞儀檢測25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mLORS作用人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞48h后對細(xì)胞凋亡的影響；
　　 4、流式細(xì)胞儀分析100μg/mLORS作用人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞12h、24h、48h后對細(xì)胞周期的影響；
　　 5、WesternBlotti

4、ng法檢測100μg/mLORS作用人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞48h后凋亡相關(guān)的Bc1-2、Bax、Bad蛋白的表達(dá)情況：以及分別加入MAPK通路激動劑、MAPK各主要通路抑制劑后各處理組的ERK、JNK、P38磷酸化蛋白與總蛋白的表達(dá)情況，以探討ORS對MAPK信號通路的調(diào)控作用；
　　 6、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測25μg/mL、100μg/mL、400μg/mLORS作用人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞48h后凋亡相

5、關(guān)baxmRNA、Bc1-2mRNA、badmRNA的表達(dá)情況。
　　 研究結(jié)果：
　　 1、當(dāng)ORS的劑量逐漸增加與用藥時(shí)間的逐漸延長后，對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)；在劑量為12.5μg/mL，時(shí)間為72h組，劑量為25μg/mL，時(shí)間為48h、72h組，以及劑量為50～400μg/mL的三個(gè)時(shí)間段各組別的抑制率與陰性對照組比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01或P＜0.05)。
　　

6、 2、倒置相差顯微鏡下觀察顯示：用藥組的MDA-MB-231細(xì)胞隨ORS劑量的逐漸增加，形態(tài)逐漸皺縮變圓，漂浮，細(xì)胞密度逐漸減少，間隙逐漸增大，胞漿顆粒增多，增殖變慢，甚則細(xì)胞裂解為若干碎片；正常對照組MDA-MB-231細(xì)胞呈飽滿梭形貼壁生長，細(xì)胞輪廓清楚，排列緊密，細(xì)胞生長旺盛。透射電鏡觀察顯示：100μg/mLORS作用人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞48h后發(fā)生體積皺縮，細(xì)胞表面絨毛減少，核膜消失，核質(zhì)萎縮、碎裂，個(gè)別形成凋亡

7、小體；部分染色質(zhì)固縮，沿核膜形成數(shù)個(gè)團(tuán)塊狀邊集；細(xì)胞器外滲、腫脹，空泡狀明顯增多。正常對照組細(xì)胞膜表面光滑、完整，可見微絨毛，胞質(zhì)密度高，無空泡，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻、核仁大較完整，居中或邊移；細(xì)胞器亞微結(jié)構(gòu)較清晰、完整。
　　 3、人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)過不同劑量的ORS處理48h后，各劑量ORS組均出現(xiàn)不同程度的凋亡，且細(xì)胞的凋亡比例在早、中晚期均呈現(xiàn)出隨劑量增高而增長的態(tài)勢。各劑量ORS組細(xì)胞的總凋亡率與正常對照

8、組比較，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；各劑量ORS組兩兩比較總凋亡率，除25μg/mL組與50μg/mL組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P＞0.05)，其余組間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01）。
　　 4、100μg/mL的ORS作用于人乳腺M(fèi)DA-MB-231細(xì)胞后，與正常對照組比較，ORS組G0/G1期的細(xì)胞比例隨作用時(shí)間延長在逐漸增加，而S期的細(xì)胞比例隨作用時(shí)間延長在逐漸減少，細(xì)胞的增殖被明顯地阻滯于G0/G

9、1朝，表明ORS對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖周期的影響具有時(shí)間依賴性。
　　 5、1)100μg/mLORS單獨(dú)作用MDA-MB-231細(xì)胞48h后，p-ERK蛋白表達(dá)較正常對照組比較出現(xiàn)明顯減弱，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，p-JNK通路蛋白及p-P38蛋白的表達(dá)較正常對照組均明顯增強(qiáng)，均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　 2)100μg/mLORS分別與三種通路抑制劑聯(lián)合作用于MDA-MB-

10、231細(xì)胞后，①從ERK通道層面來觀察，ERK抑制劑(PD98059)聯(lián)合組作用于細(xì)胞后，p-ERK蛋白表達(dá)較正常對照組與單獨(dú)ORS組均呈現(xiàn)進(jìn)一步減弱趨勢，均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），而P38抑制劑(SB203580)聯(lián)合組與JNK抑制劑(SP600125)聯(lián)合組處作用于細(xì)胞后，p-ERK蛋白表達(dá)較正常對照組都有減弱趨勢，前者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，但較ORS單獨(dú)作用組而言則出現(xiàn)了p-ERK蛋白表達(dá)增強(qiáng)的態(tài)勢，二者均有統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；②從JNK通路層面來觀察，ORS作用經(jīng)三種抑制劑處理過的細(xì)胞后，p-JNK蛋白的表達(dá)較正常對照組均出現(xiàn)了增強(qiáng)趨勢，其中P38抑制劑聯(lián)合組與FRK抑制劑聯(lián)合組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，但較ORS單獨(dú)作用組則出現(xiàn)了減弱態(tài)勢，JNK抑制劑聯(lián)合組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；③從P38通路層面來觀察，ORS作用經(jīng)三種抑制劑處理過的細(xì)胞后，p-P38蛋白的表達(dá)較正常對照組也均出現(xiàn)了增強(qiáng)的趨勢，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0

12、.01)，較ORS組而言仍然均呈現(xiàn)出減弱態(tài)勢。
　　 3)隨著ORS濃度的增加，三個(gè)劑量的ORS作用MDA-MB-231細(xì)胞48h后，Bax蛋白的表達(dá)均不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但Bcl-2蛋白的表達(dá)均下調(diào)，其中100μg/mL與400μg/mL組較正常對照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)性差異(P＜0.01)；縱觀Bax蛋白/Bcl-2蛋白，100μg/mL與400μg/mL組較正常對照組均呈上升，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；

13、而Bad蛋白的表達(dá)是隨ORS濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，三個(gè)劑量組較正常對照組均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　 6、100μg/mLORS作用MDA-MB-231細(xì)胞48h后對BaxmRNA的表達(dá)量上調(diào)，較正常對照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，25μg/mLORS作用組與10μg/mLORS作用組的Bcl-2mRNA的表達(dá)較正常對照組均呈下調(diào)，其中25μg/mL作用組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，縱觀BaxmRN

14、A/Bcl-2mRNA，25μg/mL與100μg/mLORS作用組較正常對照組均呈上調(diào)，其中100μg/mL作用組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);100μg/mL與400μg/mLORS作用組對BadmRNA的表達(dá)較正常對照組均呈明顯上調(diào)，均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　 研究結(jié)論：
　　 1、ORS具有抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖的作用，且抑制效應(yīng)呈明顯的量效與時(shí)效關(guān)系，其機(jī)制可能與ORS通過ERK/MA

15、PK途徑影響了cyclinD的過度表達(dá)，使得細(xì)胞增殖被阻滯于G0/G1期相關(guān)。
　　 2、ORS能夠誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生凋亡，并引起細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)的凋亡形態(tài)學(xué)改變，其機(jī)制可能與ORS對MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的ERK、JNK、P38途徑的綜合調(diào)控有關(guān)，ORS的作用位點(diǎn)可能位于ERK、JNK、P38信號通路的上游，或者由其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的介入而產(chǎn)生的互聯(lián)調(diào)控效應(yīng)；并且在細(xì)胞凋亡過程中顯示出ORS誘導(dǎo)MDA-MA-231細(xì)胞凋

16、亡的效應(yīng)與JNK、P38的通路的激活成正相關(guān)，而與ERK通路的激活呈負(fù)相關(guān)。
　　 3、ORS誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制也可能與ORS調(diào)控Bcl-2家族的Bax、Bcl-2、Bad蛋白以及BaxmRNA、Bcl-2mRNA、BadmRNA的綜合表達(dá)有關(guān)。其總的調(diào)節(jié)趨勢為抑凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)減弱，總Bax蛋白/Bcl-2蛋白上升，促凋亡Bad蛋白表達(dá)增強(qiáng)；抑凋亡基因Bcl-2mRNA表達(dá)下調(diào)，總BaxmRNA/