虎眼萬年青總皂苷對乳腺癌細胞增殖與凋亡的影響及機制研究.pdf

1、研究目的：
　　 本課題根據(jù)“癌毒學說”，旨在研究虎眼萬年青總皂苷對乳腺癌細胞增殖與凋亡的影響，對細胞MAPK信號通路蛋白及凋亡相關蛋白與基因的表達調控作用，以初步探討虎眼萬年青抗乳腺癌的有效分子作用機制。
　　 研究意義：
　　 為抗癌毒新藥的進一步研發(fā)及抗癌解毒治則的合理應用提供必要的理論與實驗依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1、采用MTT比色法檢測ORS對ER(+)人乳腺癌MCF-7細胞與E

2、R（—）人乳腺癌MDA-MB-231細胞體外增殖的抑制效應，篩選出敏感細胞、各自的有效作用劑量和有效作用時間，并判定效量、時效關系；
　　 2、倒置顯微鏡觀察25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、400μg/mLORS作用于ER(+)人乳腺癌MCF-7細胞與ER（—）人乳腺癌MDA-MB-231細胞48h后對細胞形態(tài)學的影響；透射電鏡觀察100μg/mLORS作用于人乳腺癌MDA-MB-231細胞48h后，細胞形態(tài)、

3、結構的變化，以及是否出現(xiàn)核質濃縮，凋亡小體、染色質邊集等現(xiàn)象；
　　 3、AnnexinV-FITC染色流式細胞儀檢測25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mLORS作用人乳腺癌MDA-MB-231細胞48h后對細胞凋亡的影響；
　　 4、流式細胞儀分析100μg/mLORS作用人乳腺癌MDA-MB-231細胞12h、24h、48h后對細胞周期的影響；
　　 5、WesternBlotti

4、ng法檢測100μg/mLORS作用人乳腺癌MDA-MB-231細胞48h后凋亡相關的Bc1-2、Bax、Bad蛋白的表達情況：以及分別加入MAPK通路激動劑、MAPK各主要通路抑制劑后各處理組的ERK、JNK、P38磷酸化蛋白與總蛋白的表達情況，以探討ORS對MAPK信號通路的調控作用；
　　 6、實時熒光定量PCR法檢測25μg/mL、100μg/mL、400μg/mLORS作用人乳腺癌MDA-MB-231細胞48h后凋亡相

5、關baxmRNA、Bc1-2mRNA、badmRNA的表達情況。
　　 研究結果：
　　 1、當ORS的劑量逐漸增加與用藥時間的逐漸延長后，對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用逐漸增強；在劑量為12.5μg/mL，時間為72h組，劑量為25μg/mL，時間為48h、72h組，以及劑量為50～400μg/mL的三個時間段各組別的抑制率與陰性對照組比較，均具有統(tǒng)計學差異(P＜0.01或P＜0.05)。
　　

6、 2、倒置相差顯微鏡下觀察顯示：用藥組的MDA-MB-231細胞隨ORS劑量的逐漸增加，形態(tài)逐漸皺縮變圓，漂浮，細胞密度逐漸減少，間隙逐漸增大，胞漿顆粒增多，增殖變慢，甚則細胞裂解為若干碎片；正常對照組MDA-MB-231細胞呈飽滿梭形貼壁生長，細胞輪廓清楚，排列緊密，細胞生長旺盛。透射電鏡觀察顯示：100μg/mLORS作用人乳腺癌MDA-MB-231細胞48h后發(fā)生體積皺縮，細胞表面絨毛減少，核膜消失，核質萎縮、碎裂，個別形成凋亡

7、小體；部分染色質固縮，沿核膜形成數(shù)個團塊狀邊集；細胞器外滲、腫脹，空泡狀明顯增多。正常對照組細胞膜表面光滑、完整，可見微絨毛，胞質密度高，無空泡，核內染色質分布均勻、核仁大較完整，居中或邊移；細胞器亞微結構較清晰、完整。
　　 3、人乳腺癌MDA-MB-231細胞經(jīng)過不同劑量的ORS處理48h后，各劑量ORS組均出現(xiàn)不同程度的凋亡，且細胞的凋亡比例在早、中晚期均呈現(xiàn)出隨劑量增高而增長的態(tài)勢。各劑量ORS組細胞的總凋亡率與正常對照

8、組比較，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；各劑量ORS組兩兩比較總凋亡率，除25μg/mL組與50μg/mL組之間無統(tǒng)計學意義外(P＞0.05)，其余組間均具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05或P＜0.01）。
　　 4、100μg/mL的ORS作用于人乳腺MDA-MB-231細胞后，與正常對照組比較，ORS組G0/G1期的細胞比例隨作用時間延長在逐漸增加，而S期的細胞比例隨作用時間延長在逐漸減少，細胞的增殖被明顯地阻滯于G0/G

9、1朝，表明ORS對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖周期的影響具有時間依賴性。
　　 5、1)100μg/mLORS單獨作用MDA-MB-231細胞48h后，p-ERK蛋白表達較正常對照組比較出現(xiàn)明顯減弱，具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，p-JNK通路蛋白及p-P38蛋白的表達較正常對照組均明顯增強，均具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。
　　 2)100μg/mLORS分別與三種通路抑制劑聯(lián)合作用于MDA-MB-

10、231細胞后，①從ERK通道層面來觀察，ERK抑制劑(PD98059)聯(lián)合組作用于細胞后，p-ERK蛋白表達較正常對照組與單獨ORS組均呈現(xiàn)進一步減弱趨勢，均具有顯著統(tǒng)計學差異（P＜0.01），而P38抑制劑(SB203580)聯(lián)合組與JNK抑制劑(SP600125)聯(lián)合組處作用于細胞后，p-ERK蛋白表達較正常對照組都有減弱趨勢，前者有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，但較ORS單獨作用組而言則出現(xiàn)了p-ERK蛋白表達增強的態(tài)勢，二者均有統(tǒng)

11、計學差異(P＜0.05)；②從JNK通路層面來觀察，ORS作用經(jīng)三種抑制劑處理過的細胞后，p-JNK蛋白的表達較正常對照組均出現(xiàn)了增強趨勢，其中P38抑制劑聯(lián)合組與FRK抑制劑聯(lián)合組有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，但較ORS單獨作用組則出現(xiàn)了減弱態(tài)勢，JNK抑制劑聯(lián)合組有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；③從P38通路層面來觀察，ORS作用經(jīng)三種抑制劑處理過的細胞后，p-P38蛋白的表達較正常對照組也均出現(xiàn)了增強的趨勢，有明顯統(tǒng)計學差異(P＜0

12、.01)，較ORS組而言仍然均呈現(xiàn)出減弱態(tài)勢。
　　 3)隨著ORS濃度的增加，三個劑量的ORS作用MDA-MB-231細胞48h后，Bax蛋白的表達均不明顯，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，但Bcl-2蛋白的表達均下調，其中100μg/mL與400μg/mL組較正常對照組有顯著統(tǒng)計學性差異(P＜0.01)；縱觀Bax蛋白/Bcl-2蛋白，100μg/mL與400μg/mL組較正常對照組均呈上升，有顯著統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；

13、而Bad蛋白的表達是隨ORS濃度的增加而逐漸增強，三個劑量組較正常對照組均具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。
　　 6、100μg/mLORS作用MDA-MB-231細胞48h后對BaxmRNA的表達量上調，較正常對照組有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，25μg/mLORS作用組與10μg/mLORS作用組的Bcl-2mRNA的表達較正常對照組均呈下調，其中25μg/mL作用組有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，縱觀BaxmRN

14、A/Bcl-2mRNA，25μg/mL與100μg/mLORS作用組較正常對照組均呈上調，其中100μg/mL作用組有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);100μg/mL與400μg/mLORS作用組對BadmRNA的表達較正常對照組均呈明顯上調，均有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。
　　 研究結論：
　　 1、ORS具有抑制MDA-MB-231細胞增殖的作用，且抑制效應呈明顯的量效與時效關系，其機制可能與ORS通過ERK/MA

15、PK途徑影響了cyclinD的過度表達，使得細胞增殖被阻滯于G0/G1期相關。
　　 2、ORS能夠誘導MDA-MB-231細胞發(fā)生凋亡，并引起細胞發(fā)生相應的凋亡形態(tài)學改變，其機制可能與ORS對MAPK信號轉導通路的ERK、JNK、P38途徑的綜合調控有關，ORS的作用位點可能位于ERK、JNK、P38信號通路的上游，或者由其它信號轉導通路的介入而產(chǎn)生的互聯(lián)調控效應；并且在細胞凋亡過程中顯示出ORS誘導MDA-MA-231細胞凋

16、亡的效應與JNK、P38的通路的激活成正相關，而與ERK通路的激活呈負相關。
　　 3、ORS誘導MDA-MB-231細胞發(fā)生凋亡的機制也可能與ORS調控Bcl-2家族的Bax、Bcl-2、Bad蛋白以及BaxmRNA、Bcl-2mRNA、BadmRNA的綜合表達有關。其總的調節(jié)趨勢為抑凋亡Bcl-2蛋白表達減弱，總Bax蛋白/Bcl-2蛋白上升，促凋亡Bad蛋白表達增強；抑凋亡基因Bcl-2mRNA表達下調，總BaxmRNA/