金屬輔基對神經紅蛋白結構和性質的影響.pdf

1、神經紅蛋白(Neuroglobin,NGB)是2000年由德國科學家Burmester,T等在人和鼠腦中發(fā)現(xiàn)的一種新穎的珠蛋白。相對于血紅蛋白和肌紅蛋白中血紅素Fe的五配位形式,神經紅蛋白中的血紅素Fe是六配位形式。這種結構的蛋白在脊椎動物中還屬于首例,新的結構必然會賦予該蛋白新的性質與功能。為研究NGB的基本化學生物學性質及金屬輔基與蛋白結構和性質之間的關系,我們研究了脫輔基神經紅蛋白(apoNGB)的結構和性質,并研究了錳、鈷卟啉重

2、組神經紅蛋白的結構和性質,進一步研究了酯化血紅素重組神經紅蛋白的結構及性質。
　　1.分別用丁酮萃取法和酸丙酮法制備了apoNGB。用丁酮萃取法制備的apoNGB產率高(90％以上),結構穩(wěn)定,但還含有一定的全蛋白;而用酸丙酮法制備的apoNGB較純,但產率相對較低(70%左右),結構穩(wěn)定性低。和NGB相比,apoNGB的色氨酸進一步暴露于極性溶劑中,α-螺旋的含量降低。
　　2. apoNGB的去折疊研究。apoNGB在酸

3、中去折疊過程為:天然態(tài)(N)?部分去折疊態(tài)(UA)?熔球態(tài)(MG)。apoNGB的熱變性研究表明,apoNGB和NGB的熱變性中點為66.0℃和90.8℃,說明血紅素輔基對蛋白的肽鏈具有穩(wěn)定作用。尿素濃度達到9 mol·L-1時,apoNGB的肽鏈并沒有完全伸展,主要是色氨酸逐漸暴露于極性環(huán)境中。在9 mol·L-1尿素下,熒光探針ANS結合在肽鏈上的疏水區(qū)域并沒有完全暴露于極性溶劑中;而在4 mol·L-1鹽酸胍下,此疏水區(qū)域則完全暴

4、露于極性溶劑中。apoNGB在鹽酸胍中變性完全,鹽酸胍的變性能力明顯高于尿素。熒光相圖表明,apoNGB在鹽酸胍和尿素中的去折疊過程不同。由ANS和脫輔基神經紅蛋白結合的熒光光譜得到其解離常數(shù)KD=14μmol·L-1,結合部位數(shù)n為1.2。ANS-apoNGB的熒光可被1.2倍的血紅素所猝滅,說明ANS結合在apoNGB的血紅素區(qū)域。
　　3.利用UV-Vis光譜和熒光光譜研究了apoNGB與錳卟啉的結合過程。結果表明,當兩者濃

5、度相等時,反應基本到達平衡,說明apoNGB與錳卟啉以1:1的摩爾比結合。用UV-Vis光譜、熒光光譜、CD光譜、電噴霧質譜對錳卟啉重組蛋白(Mn-NGB)進行了表征。小分子配體SCN-、N3-、CN-與Mn-NGB不反應,說明Mn-NGB表現(xiàn)為反應較惰性。Mn-NGB的鹽酸胍變性研究表明,隨著蛋白肽鏈的去折疊,錳卟啉從肽鏈上脫離下來。Mn-NGB穩(wěn)定性小于NGB。熒光相圖表明,Mn-NGB在鹽酸胍中的去折疊存在三種狀態(tài)。Mn-NGB的

6、熱變性中點為74.7℃,說明Mn-NGB的熱穩(wěn)定性降低。因此,卟啉中錳金屬的替換影響了輔基的配位環(huán)境,對蛋白質中的空間構象產生了微擾,從而導致蛋白肽鏈的穩(wěn)定性有所下降。
　　4.利用UV-Vis光譜和熒光光譜研究了apoNGB與鈷卟啉的結合過程。結果表明,當兩者濃度相等時,反應基本到達平衡,說明apoNGB與鈷卟啉以1:1的摩爾比結合。用UV-Vis光譜、熒光光譜、CD光譜對鈷卟啉重組蛋白(Co-NGB)進行了表征。小分子配體SC

7、N-、N3-與Co-NGB不反應,但CN-可反應,說明Co-NGB較Mn-NGB反應性高些。Co-NGB的鹽酸胍變性研究表明,鈷卟啉并沒有從肽鏈上脫離下來。Co-NGB在鹽酸胍中的去折疊符合―兩態(tài)模型‖。Co-NGB鹽酸胍CD變性曲線不同于NGB,說明鈷金屬影響了蛋白和變性劑的相互作用。Co-NGB的熱變性中點為82.7℃,說明Co-NGB的熱穩(wěn)定性下降。Co-NGB在不同pH下的去折疊研究表明:Co-NGB在堿性條件下比較穩(wěn)定;而在酸

8、性條件下則先形成部分去折疊態(tài),然后再形成熔球態(tài)。ANS熒光光譜表明, ANS不能和Co-NGB結合。
　　5.合成了氯化血紅素的衍生物對甲基苯酚雙酯氯化血紅素和苯酚雙酯氯化血紅素,采用電噴霧質譜,紫外-可見吸收光譜等進行了表征。將人工合成的氯化血紅素的雙酯衍生物與apoNGB重組,制備得到了酯化血紅素重組NGB。重組NGB的光譜表明,重組NGB的ASoret/A280值都小于NGB(3.0),重組NGB的色氨酸進一步暴露于極性環(huán)境