單葉鐵線蓮總皂苷提取、純化工藝及抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的初步研究.pdf

1、一、目的
　　 建立單葉鐵線蓮總皂苷(TsCH)TsCH的含量測(cè)定方法,研究適宜TsCH提取和純化的工藝條件,考察TsCH的抗炎活性及作用機(jī)制,充分利用單葉鐵線蓮資源,開發(fā)以TsCH為主要成分治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的中藥新藥。
　　 二、方法
　　 1.TsCH的含量測(cè)定:選用齊墩果酸為對(duì)照品,采用比色法,以5％香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸為顯色劑,在550nm處測(cè)定吸光度。以齊墩果酸的量(mg)為橫坐標(biāo),以吸光度(A)

2、為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得回歸方程,進(jìn)行方法學(xué)考察。
　　 2.TsCH微波提取工藝:以TsCH轉(zhuǎn)移率為指標(biāo),將微波提取法與加熱回流提取法及超聲提取法進(jìn)行比較;在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),篩選最佳微波提取工藝。
　　 3.TsCH的純化工藝:采用靜態(tài)吸附-解吸和動(dòng)態(tài)吸附-洗脫考察相結(jié)合的方法,篩選5種不同性質(zhì)的大孔樹脂;根據(jù)篩選出來(lái)的樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附洗脫參數(shù)的考察。
　　 4.TsCH對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)

3、炎大鼠作用的考察:雌性SD大鼠48只,隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組,模型對(duì)照組,陽(yáng)性對(duì)照(甲氨蝶呤,1 mg·kg-1·w-1)組,TsCH高、低劑量組(150、50mg·kg-1·d-1)。除正常對(duì)照組外,其余注射Ⅱ型膠原造模。灌胃給藥,持續(xù)5周,觀察動(dòng)物一般情況及體重,測(cè)定足趾容積和厚度。5周后處死動(dòng)物,腹主動(dòng)脈采血測(cè)定血清中免疫球蛋白G(IgG)、白介素-1β(IL1-β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量;取大鼠踝關(guān)節(jié)組織切片,檢查

4、關(guān)節(jié)組織病理學(xué)。
　　 三、結(jié)果
　　 1.TsCH的含量:測(cè)定所得回歸方程為Y=3.5913X+0.0077,相關(guān)系數(shù)R2=0.9994,線性范圍0.036～0.216 mg。以此計(jì)算TsCH的含量。方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,顯色在120min內(nèi)吸收值穩(wěn)定,RSD為1.97％,精密度和重復(fù)性良好,RSD分別1.04％和3.11％;平均回收率為97.90％(n=9),RSD為2.08％。
　　 2.TsCH微波提取工藝

5、結(jié)果表明,以70％乙醇為提取溶劑,微波功率300W,料液比1:26,提取3次,每次提取6 min,TsCH的轉(zhuǎn)移率可達(dá)95％左右。
　　 3.TsCH的純化工藝:根據(jù)靜態(tài)吸附、洗脫實(shí)驗(yàn)初步確立了D-101型大孔樹脂為分離TsCH的樹脂,動(dòng)態(tài)考察所得純化工藝參數(shù)為:上樣濃度為0.2 g生藥·mL-1,pH值為5,以1 BV/h的流速上樣,4 BV蒸餾水2 BV/h的流速洗脫雜質(zhì),4 BV70％乙醇以2 BV/h的流速洗脫總皂苷。研

6、究結(jié)果表明,未純化前總固物中總皂苷的含量為29.95％,純化后總固物中的TsCH含量為71.56％,精制度達(dá)238.92％,轉(zhuǎn)移率達(dá)到86.03％。
　　 4.TsCH對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠作用的考察觀察:TsCH對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),注射Ⅱ型膠原兩次,21天后造模成功。與模型組相比,TsCH能明顯降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分,減小足趾容積,足趾厚度有降低趨勢(shì);能降低血清中IgG、IL1-β、TNF-α水平;關(guān)節(jié)組織病理學(xué)