基于SIRT1通路研究黃芪甲苷、蚓激酶對氧化應(yīng)激狀態(tài)下NRK--52E細胞的保護作用.pdf

1、目的：研究黃芪甲苷、蚓激酶在NRK-52E細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下對SIRT1通路相關(guān)因子的調(diào)節(jié)作用以及對細胞的抗氧化保護。
　　方法：選擇大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)，進行復(fù)蘇與傳代試培養(yǎng)后，采用隨機分組法將細胞分為正常組(Norm)、模型組(H2O2)、白藜蘆醇組(Res)、黃芪甲苷組(AS-Ⅳ)及蚓激酶組(Lumb)。每組細胞進行分皿接種培養(yǎng)，當鋪板率達到75-85％時，分別予以不同的藥物預(yù)處理24h，其中：Res組加入2

2、5μmol/L的白藜蘆醇培養(yǎng)液，AS-Ⅳ組加入25mmol/L的黃芪甲苷培養(yǎng)液，Lumb組加入150U/mL的蚓激酶培養(yǎng)液，Norm組和H2O2組不作處理;24h后，除Norm組外，各組均加入300μmol/L H2O2的細胞培養(yǎng)液處理30min，30min后終止刺激，PBS換液，觀察各組細胞在鏡下普通白光的形態(tài)表現(xiàn);收集細胞，用Western blot檢測SIRT1通路中SIRT1、Nrf2、SOD2、FOXO3α、PGC-1α的蛋白

3、表達量;收集細胞，將細胞裂解后用MDA試劑盒及酶標儀檢測各組細胞MDA反應(yīng)OD值;使用CCK8試劑與酶標儀檢測各組細胞生長活力反應(yīng)OD值;使用帶熒光的多功能酶標儀檢測各組細胞ROS探針OD值;使用流式細胞檢測儀測試各組ROS熒光探針表達量;使用熒光倒置顯微鏡觀察各組細胞內(nèi)ROS探針的熒光強度。實驗數(shù)據(jù)由統(tǒng)計分析軟件SPSS22進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：1.細胞形態(tài)變化：與Norm組相比，H2O2組

4、細胞出現(xiàn)背光通透性增高、壞死細胞增多以及細胞連接破壞的表現(xiàn)，Res、AS-Ⅳ、Lumb三組與H2O2組相比均有改善;2.CCK8：(1)用H2O2與藥物分別刺激24h（藥物組未加H2O2）：H2O2組的細胞活力較Norm組明顯下降(P＜0.05)，且隨H2O2濃度增加而降低;Res、AS-Ⅳ、Lumb三組的細胞活力在低劑量時與Norm組沒有差別，在高劑量時，Res與AS-Ⅳ兩組細胞活力較Norm組增加(P＜0.05)，而Lumb組較No

5、rm組細胞活力降低(P＜0.05);(2)H2O2刺激30min（藥物組已加H2O2）：在刺激結(jié)束后1h內(nèi)，各組細胞的OD值反應(yīng)活力沒有明顯改變;在刺激結(jié)束后1.5h后，與Norm組相比，H2O2組的細胞活力下降(P＜0.05);3.ROS熒光探針OD值：(1)與H2O2組相比，各組的熒光OD值均較低(P＜0.05);(2)與Norm組相比，Lumb組的熒光OD值較高(P＜0.05);4.MDA：(1)與H2O2組相比，各組MDA值均較

6、低(P＜0.01);(2)與Norm組相比，Res組和Lumb組MDA值較高(P＜0.05);5.Westemblot：(1)SOD2：與H2O2組相比，Norm組、Res組、AS-Ⅳ組和Lumb組SOD2表達均升高(P＜0.01);與Norm組相比，Res組、AS-Ⅳ組、Lumb組SOD2表達均降低(P＜0.01);(2)n-NRF2：與H2O2組比，Res組、AS-Ⅳ組n-NRF2表達升高(P＜0.05)，Norm組、Lumb組n-

7、NRF2表達降低(P＜0.01);與Norm組相比，Res組、AS-Ⅳ組n-NRF2表達升高(P＜0.05);(3)PGC-1α：與H2O2組相比，Norm組、Res組、AS-Ⅳ組、Lumb組PGC-1α表達均升高(P＜0.01);與Norm組相比，Res組、AS-Ⅳ組PGC-1α表達升高(P＜0.01)，Lumb組表達降低(P＜0.05);(4)SIRT1：與H2O2組相比，Norm組、Res組、AS-Ⅳ組、Lumb組SIRT1表達均

8、升高(P＜0.01);與Norm組相比，Res組、AS-Ⅳ組SIRT1表達升高(P＜0.01);(5)FOXO3α：與H2O2組相比，Norm組、Res組、AS-Ⅳ組、Lumb組FOXO3α表達均升高(P＜0.01);與Norm組相比，Res組、AS-Ⅳ組、Lumb組FOXO3α表達升高(P＜0.01);6.流式檢測ROS探針：(1)和H2O2組相比，Res組、AS-Ⅳ組、Lumb組的熒光細胞陽性率均降低(P＜0.05)：(2)和Nor

9、m組相比，H2O2組、Res組、AS-Ⅳ組、Lumb組的熒光細胞陽性率均升高(P＜0.01);7.熒光倒置相差顯微鏡：Norm組1（無熒光探針）無法看到細胞或熒光背景，Norm組2（有熒光探針）能看到背景的綠色雜質(zhì)，H2O2組熒光強度最強，Lumb組次之，Res組與AS-Ⅳ組較弱。
　　結(jié)論：黃芪甲苷、蚓激酶都提升了NRK-52E細胞抗氧化能力，減輕了H2O2對細胞的氧化損害。其中黃芪甲苷對SIRT1通路相關(guān)抗氧化因子具有上調(diào)作用