黃體酮對(duì)大鼠視神經(jīng)損傷視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞微管相關(guān)蛋白-1B和降鈣素基因相關(guān)肽的影響.pdf

1、目的：視神經(jīng)損傷是指外力對(duì)視神經(jīng)的沖擊性損傷，可導(dǎo)致患者部分或全部視力的喪失，是常見的致盲性眼病之一。目前臨床上治療本病主要以藥物的早期應(yīng)用為主，常以糖皮質(zhì)激素、鈣通道阻滯劑等多種藥物合用，但治療效果并不理想，因此，尋找一種安全、多效的神經(jīng)保護(hù)類藥物顯得尤為重要。近年研究表明，激素類神經(jīng)類固醇--黃體酮(progesterone，PROG)在創(chuàng)傷性腦損傷和脊髓損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示出了很好的神經(jīng)保護(hù)作用，其所具有的抗缺血、抗凋亡和促進(jìn)髓鞘

2、合成等作用越來越受到關(guān)注，成為神經(jīng)保護(hù)類藥物新的研究熱點(diǎn)，但PROG對(duì)視神經(jīng)損傷的研究尚未見報(bào)道。
　　視神經(jīng)是由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)的軸突組合而成。視神經(jīng)損傷后RGCs的進(jìn)行性的變性、凋亡及其軸突的斷裂是導(dǎo)致視功能下降的直接病理改變。研究表明，細(xì)胞骨架破壞和組織缺血、缺氧是引起RGCs變性、凋亡和阻礙軸突再生的重要因素。因此，如何促進(jìn)細(xì)胞骨架再生和減輕組織缺血、缺氧狀態(tài)成為保

3、護(hù)RGCs、提高視功能的關(guān)鍵所在。微管相關(guān)蛋白(microtubule associated protein-1B，MAP-1B)是軸突生長(zhǎng)和維持細(xì)胞骨架正常形態(tài)所必需的一種細(xì)胞骨架蛋白，在視神經(jīng)損傷后RGCs的存活和軸突再生中起著重要的作用[7]。降鈣素基因相關(guān)肽(calciton in gene-related peptide，CGRP)是一種廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)的擴(kuò)血管多肽，能夠拮抗神經(jīng)損傷后內(nèi)皮素(ET)強(qiáng)烈的縮血管效應(yīng)、改善神經(jīng)

4、元細(xì)胞的缺血、缺氧狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠視神經(jīng)損傷模型，觀察腹腔注射PROG對(duì)視神經(jīng)損傷早期RGCs的保護(hù)作用及其對(duì)視網(wǎng)膜MAP-1B及CGRP的影響，旨在為臨床視神經(jīng)保護(hù)治療方面提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：選取月齡2個(gè)月的健康雄性SD大鼠60只，體重200g±20g，隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組(不做任何處理)、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(制作右眼視神經(jīng)夾傷模型[27]，給予0.9％Nacl8.0mg/kg腹腔注射)、實(shí)驗(yàn)治療組(制作右眼視神經(jīng)夾傷

5、模型，給予PROG8.0mg/kg腹腔注射[21])，每組各20只。分別于術(shù)后1、3、7、14、28天取出大鼠右眼球制片。以視乳頭上方2mm范圍內(nèi)的視網(wǎng)膜組織作為觀察對(duì)象，HE染色光鏡下觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化并計(jì)數(shù)RGCs存活數(shù)量，免疫組化染色半定量檢測(cè)MAP-1B，CGRP在RGCs的表達(dá)情況，以陽(yáng)性細(xì)胞染色的平均光密度值(The average optical densityvalue，AOD)來表示抗原表達(dá)量，AOD越高則陽(yáng)性表達(dá)越

6、強(qiáng)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，不同組間同一時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.視網(wǎng)膜組織的光鏡結(jié)果
　　1.1 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜HE染色RGCs呈單層排列，大小不一，輪廓不規(guī)則，細(xì)胞

7、邊界較清晰。從胞核形態(tài)學(xué)可以分為大而淺染的細(xì)胞核以及小而深染的細(xì)胞核，后者居多。視神經(jīng)損傷后實(shí)驗(yàn)對(duì)照組可見視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目迅速減少，損傷早期部分節(jié)細(xì)胞出現(xiàn)水腫及空泡樣改變，另有部分細(xì)胞出現(xiàn)核溶解以及胞漿淡染。實(shí)驗(yàn)治療組視網(wǎng)膜形態(tài)改變較實(shí)驗(yàn)對(duì)照組輕，視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層僅輕度水腫，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少緩慢，損傷早期細(xì)胞形態(tài)大致正常，只有少部分出現(xiàn)核溶解及胞漿淡染，晚期視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞也出現(xiàn)水腫及空泡樣改變。
　

8、　1.2 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量改變正常對(duì)照組每×400光鏡視野平均RGCs數(shù)29.90±0.54個(gè)；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組1、3、7、14、28天每×400光鏡視野平均RGCs數(shù)分別為27.06±0.61個(gè)，23.37±0.76個(gè)，13.93±0.88個(gè)，10.07±0.82個(gè)以及4.92±0.49個(gè)；實(shí)驗(yàn)治療組各時(shí)間段平均RGCs數(shù)分別為28.99±0.36個(gè)，26.42±0.87個(gè)，17.43±0.85個(gè)，13.19±0.59個(gè)和7.07±0.

9、75個(gè)。視神經(jīng)損傷后兩實(shí)驗(yàn)組RGCs數(shù)目均呈下降趨勢(shì)，14天以前RGCs呈快速減少，14天以后RGCs減少速度變緩，1天時(shí)實(shí)驗(yàn)治療組的RGCs數(shù)目高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，3～28天各時(shí)間段實(shí)驗(yàn)治療組的RGCs數(shù)目高于對(duì)照組，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，兩實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間段RGCs數(shù)目均低于正常對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(Table1，F(xiàn)ig21)
　　2.視網(wǎng)膜MAP-1B和CGR

10、P免疫組化半定量檢測(cè)：
　　2.1 MAP-1B在視網(wǎng)膜中的表達(dá)正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜中MAP-1B陽(yáng)性呈棕黃色，主要表達(dá)于光感受器內(nèi)節(jié)；弱陽(yáng)性呈淡黃色，主要表達(dá)于少數(shù)RGCs胞漿和光感受器外節(jié)。視神經(jīng)損傷后3天，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞MAP-1B呈棕黃色陽(yáng)性表達(dá)，主要分布于RGCs的胞漿，而內(nèi)核層細(xì)胞胞漿呈淡黃色弱陽(yáng)性表達(dá)。
　　正常對(duì)照組視網(wǎng)膜RGCs層MAP-1B平均光密度值為：0.1544±0.01250；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組3、7、

11、14、28天視網(wǎng)膜MAP-1B的AOD分別為：0.2623±0.0734，0.2994±0.00811，0.2199±0.01944和0.1074±0.00632；實(shí)驗(yàn)治療組各時(shí)間段視網(wǎng)膜MAP-1B的AOD較實(shí)驗(yàn)對(duì)照組高，分別為0.3029±0.01001，0.3619±0.01671，0.3989±0.01463以及0.1128±0.00578。視神經(jīng)損傷后3天時(shí)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和治療組RGCs層開始有MAP-1B陽(yáng)性表達(dá)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組7天

12、時(shí)MAP-1B表達(dá)最強(qiáng)，高于同組其它時(shí)間段，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，14天時(shí)表達(dá)明顯減弱。實(shí)驗(yàn)治療組14天內(nèi)MAP-1B的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，14天時(shí)最強(qiáng)，明顯高于同組其它時(shí)間段(p<0.05)，表達(dá)部位同實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與治療組28天時(shí)MAP-1B的表達(dá)明顯減弱，且兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與治療組的視網(wǎng)膜RGCs層MAP-1B的AOD均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。(Table2，

13、Fig22)
　　2.2 CGRP在視網(wǎng)膜中的表達(dá)：
　　正常對(duì)照組大鼠CGRP主要在視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層和外叢狀層表達(dá)，呈棕黃色，在少數(shù)RGCs胞漿可見淡黃色CGRP表達(dá)。視神經(jīng)損傷后，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)CGRP表達(dá)量增高，呈棕黃色。
　　正常對(duì)照組視網(wǎng)膜CGRP的AOD為：0.1544±0.01250；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組3、7、14、28天視網(wǎng)膜CGRP的AOD分別為：0.2516±0.01156，0.3708±0.01185，

14、0.2655±0.00960與0.1998±0.00540；實(shí)驗(yàn)治療組各時(shí)間段視網(wǎng)膜CGRP的AOD分別為：0.2902±0.01733，0.3926±0.00765，0.2801±0.00446及0.2245±0.00672；視神經(jīng)損傷后7天內(nèi)兩實(shí)驗(yàn)組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞CGRP陽(yáng)性表達(dá)均逐漸增加，7天時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，高于同組其它時(shí)間段，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，且3、7、14天時(shí)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞CGRP表達(dá)量實(shí)驗(yàn)治療組均高于實(shí)驗(yàn)

15、對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。視神經(jīng)損傷7天后兩組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞CGRP陽(yáng)性表達(dá)逐漸減弱，28天時(shí)降至最低，此時(shí)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞CGRP表達(dá)量實(shí)驗(yàn)治療組高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。(Table3，F(xiàn)ig23)
　　結(jié)論：
　　1.視神經(jīng)損傷早期已出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷和凋亡，而腹腔注射PROG可以減輕視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷，延緩視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。
　　2.視神經(jīng)損傷

16、后兩實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜CGRP的表達(dá)量較正常組明顯增高，而腹腔注射PROG可以增加CGRP在視網(wǎng)膜的表達(dá)，說明擴(kuò)血管肽CGRP參與了視神經(jīng)損傷和修復(fù)的過程，PROG保護(hù)視神經(jīng)損傷的機(jī)制與增加擴(kuò)血管肽CGRP表達(dá)有關(guān)。
　　3.視神經(jīng)損傷后兩實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的MAP-1B表達(dá)量較正常組明顯增高，而腹腔注射PROG可以增加視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞MAP-1B的表達(dá)。說明細(xì)胞MAP-1B參與了視神經(jīng)損傷和再生的過程，PROG保護(hù)視神經(jīng)損傷、促進(jìn)