EGR1、PRP相關(guān)生長(zhǎng)因子對(duì)兔肩袖損傷后肌腱修復(fù)的影響.pdf

1、目的：
　　研究EGR1對(duì)肌腱干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化能力及EGR1、PRP相關(guān)生長(zhǎng)因子對(duì)兔肩袖損傷后肌腱修復(fù)的影響。
　　方法：
　　(1)采用酶消化法取新西蘭大白兔髕韌帶中間部分肌腱組織，經(jīng)過酶切處理及培養(yǎng)后分離、純化得到肌腱干細(xì)胞（TSCs），之后免疫熒光染色檢測(cè)4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、TNMD抗體和SCX抗體并在熒光顯微鏡下觀察進(jìn)一步證實(shí)鑒定TSCs細(xì)胞。
　　(2)用帶有表達(dá) EGR1基因的質(zhì)

2、粒（pCDNA-EGR1）轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組 TSCs，用空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組 TSCs。應(yīng)用短片段發(fā)夾 RNA（shRNA）lentiviral微粒靶向干擾TSCs中BMP12和Smad1基因的表達(dá)。在EGR1的作用下實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的TSCs分別誘導(dǎo)培養(yǎng)14天向肌腱細(xì)胞分化，分離純化得到肌腱細(xì)胞，應(yīng)用免疫熒光染色和定量PCR對(duì)肌腱細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并對(duì)其相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
　　(3)通過RNA提取與實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)（qRT-PCR），在

3、基因水平比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組 TSCs分化生成肌腱細(xì)胞的能力，并在 TSCs分化培養(yǎng)過程中（0h,12h,1d,3d,7d,14d）提取蛋白質(zhì)并應(yīng)用 Western blotting檢測(cè)：通過BMP12/Smad1/5/8通路生成的蛋白產(chǎn)物并與正常肌腱愈合時(shí)產(chǎn)生這些產(chǎn)物作比較。
　　(4)建立兔肩袖損傷模型（共40只），每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物切斷右側(cè)肩關(guān)節(jié)岡上肌肌腱，對(duì)左側(cè)肩關(guān)節(jié)行假手術(shù)處理形成對(duì)照組。損傷模型建立后6周行肩袖修補(bǔ)手術(shù)，并將實(shí)

4、驗(yàn)動(dòng)物分為三組（每組10只）：A組，單純修補(bǔ)手術(shù)；B組，修補(bǔ)手術(shù)+TSCs植入（肌腱損傷部位）；C組，修補(bǔ)手術(shù)+EGR1-TSCs植入（肌腱損傷部位）+PRP注射（肌腱-骨界面）。肩袖修補(bǔ)手術(shù)后8周，處死所有組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，獲取每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雙側(cè)肱骨大結(jié)節(jié)連同附著于其上的岡上肌肌腱。每組取出3分樣本用于mRNA提取和蛋白質(zhì)提取（用于Western blotting）；每組中剩余組織樣本（包括取自手術(shù)修補(bǔ)部位的岡上肌肌腱及肱骨大結(jié)節(jié)）制成5μm

5、厚的石蠟切片，進(jìn)行HE染色、免疫組化分析及來評(píng)估I型膠原蛋白的形成情況，評(píng)價(jià)肌腱的愈合情況。
　　結(jié)果：
　　(1) TSCs肌腱干細(xì)胞培養(yǎng)成功，DAPI標(biāo)記的第三代TSCs細(xì)胞核可見明亮藍(lán)色熒光（圖3），標(biāo)記率達(dá)100％，細(xì)胞活性較高。NMD、SCX染色細(xì)胞質(zhì)呈綠色熒光，可觀察細(xì)胞整體形態(tài)及分布狀況良好。
　　(2)實(shí)驗(yàn)組TSCs表達(dá)EGR1基因，對(duì)照組TSCs無表達(dá)。短片段發(fā)夾RNA（shRNA） lentivir

6、al微粒靶向干擾TSCs中分化成功，分離純化得到肌腱細(xì)胞，免疫熒光染色和定量PCR對(duì)肌腱細(xì)胞進(jìn)行鑒定顯示為肌腱細(xì)胞。
　　(3) RNA與實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)（qRT-PCR），顯示實(shí)驗(yàn)組TSCs分化生成肌腱細(xì)胞并應(yīng)用Western blotting檢測(cè)，得到BMP12/Smad1/5/8通路生成的蛋白產(chǎn)物并與正常細(xì)胞相同。
　　(4)兔肩袖損傷模型建立成功，HE染色、免疫組化分析均顯示I型膠原蛋白的形成情況良好，肌腱的愈合情