他汀類藥物對(duì)巨噬細(xì)胞胱硫醚-γ-裂解酶-硫化氫通路的調(diào)控及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：氣體信號(hào)分子硫化氫參與多種病理生理過(guò)程。在心血管系統(tǒng)，硫化氫發(fā)揮心臟保護(hù)、血管調(diào)節(jié)和抑制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的作用。最近的研究證實(shí)HMG-CoA還原酶抑制劑阿托伐他汀增加了腎臟和其他器官中硫化氫水平。然而，其內(nèi)在的機(jī)制并不明確。在本研究中，我們研究并比較三種不同的他汀氟伐他汀、阿托伐他汀和普伐他汀對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)硫化氫水平的調(diào)節(jié)，并探討其可能的分子機(jī)制。
　　方法：以小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7為工具細(xì)胞株，以三種具有不同理化性質(zhì)、

2、臨床常用的不同濃度的他汀類藥物氟伐他?。ㄖ苄?，1.25,2.5,5,10μM）、阿托伐他汀（脂溶性,10,25,50,100μM）和普伐他?。ǚ侵苄?，25,50,100μM）分別作用不同時(shí)間（24、36、48小時(shí)）。分別以經(jīng)典的亞甲藍(lán)法和特異性熒光探針WSP-1檢測(cè)培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)硫化氫水平；以定量PCR和western blotting檢測(cè)硫化氫合成酶胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）和巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶（3-MST）的mRNA和蛋白表

3、達(dá)；利用NADH的氧化聯(lián)合乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CSE活性；以siRNA干擾敲減cse基因；以western blotting檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Akt磷酸化水平變化；采用定量PCR測(cè)定細(xì)胞因子IL-1β和MCP-1 mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：三種他汀都會(huì)隨著濃度的增加而降低細(xì)胞的活力。選擇以不產(chǎn)生明顯細(xì)胞毒性作用的2.5μM氟伐他汀、50μM阿托伐他汀和普伐他汀觀察比較其對(duì)巨噬細(xì)胞中硫化氫水平的影響，發(fā)現(xiàn)氟伐他汀和阿托伐他汀

4、可以顯著增加細(xì)胞內(nèi)、外的硫化氫水平，而普伐他汀卻沒(méi)有顯著作用。氟伐他汀和阿托伐他汀呈時(shí)間和劑量依賴性地增加硫化氫合成酶CSE的mRNA和蛋白表達(dá)；但是這兩種他汀均不影響另一個(gè)硫化氫合成酶3-MST的mRNA和蛋白表達(dá)。而且，2.5μM氟伐他汀處理48小時(shí)后CSE活性增加4.4倍。CSE抑制劑炔丙基甘氨酸（PAG）和CSE的干擾RNA(siRNA)能夠顯著降低氟伐他汀引起的硫化氫水平的增加。另外，氟伐他汀作用后15分鐘，巨噬細(xì)胞內(nèi)Akt磷

5、酸化水平即顯著增加，于1-3小時(shí)達(dá)高峰，6小時(shí)開始下降。PI3K抑制劑LY294002和Akt特異性抑制劑perifosine可以逆轉(zhuǎn)氟伐他汀引起的CSE表達(dá)上調(diào)和硫化氫水平的增加。最后，我們發(fā)現(xiàn)氟伐他汀預(yù)處理可以減少細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子IL-1β和MCP-1的表達(dá)；而CSE抑制劑PAG可以逆轉(zhuǎn)氟伐他汀的該作用。
　　結(jié)論：在巨噬細(xì)胞中，親脂性他汀氟伐他汀和阿托伐他汀能夠通過(guò)上調(diào)CSE的表達(dá)及活性而促進(jìn)硫化氫的產(chǎn)生，從而發(fā)