HUVEC疫苗抗人食管鱗癌腫瘤血管生成的研究.pdf

1、由于飲食習(xí)慣、生活環(huán)境以及遺傳等因素，我國(guó)成為食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國(guó)家。雖然手術(shù)、放療和化療廣泛應(yīng)用于食管癌的治療，但食管癌治療后的五年總生存率依然小于20％。因此，我們需要研究新的策略來(lái)治療食管癌。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)腫瘤直徑生長(zhǎng)到1-2 mm的時(shí)候，腫瘤的生長(zhǎng)必須通過(guò)刺激新生血管的生成，來(lái)滿足其對(duì)氧氣和營(yíng)養(yǎng)成分的需求。因此，通過(guò)抑制腫瘤新生血管的生成來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)，成為當(dāng)前另外一種腫瘤免疫治療的新策略。目前已知的和腫瘤血管生成相關(guān)的因

2、子有30多種，通過(guò)抑制相關(guān)的通路和因子來(lái)阻斷腫瘤血管生成，也取得了一定的效果。2003年貝伐單抗(Bevacizumab)成為第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)的用于腫瘤血管生成抑制劑，隨后抗血管生成單克隆抗體逐漸應(yīng)用于臨床。但是腫瘤血管生成的方式多樣，信號(hào)通路復(fù)雜，使目前針對(duì)單一靶點(diǎn)的藥物治療效果非常有限。
　　腫瘤免疫治療是通過(guò)激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答，調(diào)動(dòng)宿主的天然防御機(jī)制，從而達(dá)到控制和殺滅腫瘤細(xì)胞的一種新的治療方法，逐漸成為繼手術(shù)、

3、放化療之后又一種腫瘤治療的重要手段。腫瘤組織新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞處于十分活躍的增殖狀態(tài)，而正常組織血管內(nèi)皮細(xì)胞一般處于靜止?fàn)顟B(tài)。以腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶點(diǎn)的主動(dòng)免疫治療，靶向腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的多個(gè)抗原，產(chǎn)生綜合抑制腫瘤血管生成的效果。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）是增殖旺盛的內(nèi)皮細(xì)胞，高表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的相關(guān)抗原，與體內(nèi)增殖活躍的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)一些相同的血

4、管內(nèi)皮細(xì)胞增殖相關(guān)抗原。以HUVEC細(xì)胞制備疫苗，靶向多個(gè)腫瘤血管增殖的相關(guān)抗原，產(chǎn)生綜合抑制腫瘤血管生成的效果。本研究構(gòu)建了人源化的 NOD/SCID小鼠食管癌移植瘤模型，探討HUVEC疫苗對(duì)人食管癌的抗腫瘤血管生成作用，為抗腫瘤血管生成免疫治療提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.通過(guò)對(duì)24只NOD/SCID小鼠眼眶后叢靜脈取血，獲得血清。利用ELISA法檢測(cè)NOD/SCID小鼠外周血血清中IgG蛋白含量，檢測(cè)小鼠是否發(fā)生“免

5、疫滲漏”現(xiàn)象，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所有小鼠血清中的IgG蛋白含量。
　　2.利用密度梯度離心法分離出人外周血的單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，然后對(duì)NOD/SCID小鼠腹腔注射PBMC(4×106個(gè)/只)進(jìn)行免疫重建。4周之后，獲得小鼠外周血，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血中人的CD45+T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況。
　　3.將免疫重建成功的小鼠隨機(jī)分為2組，一組為PBMC+

6、HUVEC組(n=8)，在小鼠左側(cè)腋窩淋巴結(jié)周圍注射HUVEC疫苗進(jìn)行免疫(5×106個(gè)/只)，1次/周，一共5次，刺激機(jī)體免疫能力的增強(qiáng)；另外一組為PBMC組（n=8）小鼠注射PBS。未免疫重建的小鼠（n=8）作為空白對(duì)照組注射PBS。一共3組進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)。
　　4.對(duì)PBS組小鼠(n=8)、PBMC組(n=8)和PBMC+ HUVEC組(n=8)小鼠分別在背部皮下接種人食管鱗癌細(xì)胞EC9706(6×106個(gè)/只)，待成瘤之后隔

7、天測(cè)量，觀察腫瘤的大小，成瘤后測(cè)量至第28天處死，得到腫瘤組織，稱重并拍照。分別取3組小鼠的血清用ELISA法進(jìn)行抗HUVEC抗體效價(jià)檢測(cè)，測(cè)量450 nm的OD值檢測(cè)小鼠血清中抗腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞抗體生成情況。隨后，通過(guò)血紅蛋白測(cè)定實(shí)驗(yàn)，將小鼠腫瘤組織研磨，并利用試劑盒在540 nm檢測(cè)腫瘤組織研磨物上清中血紅蛋白的濃度；將小鼠腫瘤組織用中性甲醛固定，石蠟包塊，然后利用免疫組織化學(xué)技術(shù)，孵育抗體CD31，然后用DAB顯色液染色，檢查腫瘤

8、組織中CD31的表達(dá)，以檢測(cè)腫瘤組織新生血管的生成情況。
　　5.剝離小鼠脾臟組織，稱重并拍照；將小鼠脾臟組織研磨，過(guò)濾并用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，淋巴細(xì)胞分離液分離得到淋巴細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組小鼠等質(zhì)量脾臟組織中CD45+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)情況。提取腫瘤組織的RNA，并用Q-PCR的方法測(cè)定腫瘤組織中VEGFR2和CD144基因的表達(dá)情況；提取腫瘤組織的蛋白，用Western blot檢測(cè)腫瘤組織VEGFR2和CD144抗

9、原的表達(dá)。運(yùn)用Western blot檢測(cè)3組小鼠血清中抗VEGFR2和CD144抗體的表達(dá)情況，以及ELISA法檢測(cè)3組小鼠血清抗HUVEC抗體的能力，來(lái)探索HUVEC疫苗抑制腫瘤血管生成的原因。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)ELISA試劑盒對(duì)小鼠外周血中的小鼠IgG含量的檢測(cè)，結(jié)合CurveExpert軟件得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到小鼠外周血中的IgG含量都小于2 ng/ml，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)；所有小鼠在后天環(huán)境的飼

10、養(yǎng)中未發(fā)生“免疫滲漏”。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)分析免疫重建4周小鼠外周血中CD45+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)量，結(jié)果顯示CD45+T淋巴細(xì)胞＞0.1%，證明免疫重建成功。
　　3.剝離小鼠腫瘤后稱量，3組小鼠腫瘤組織的重量分別是PBS組＞PBMC組＞PBMC+ HUVEC組(p＜0.01)；三組小鼠血清抗 HUVEC抗體效價(jià)：PBS組＜PBMC組＜PBMC+ HUVEC組(p＜0.05)；腫瘤組織血紅蛋白含量：PBS組＞PBMC組＞P

11、BMC+HUVEC組(p＜0.05)；免疫組化檢測(cè)腫瘤組織切片腫瘤微血管密度：PBS組＞PBMC組＞PBMC+HUVEC組(p＜0.05)。
　　4.剝離小鼠脾臟后稱量，3組小鼠脾臟組織的重量分別是PBS組＜PBMC組＜PBMC+HUVEC組(p＜0.05)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)16周3組小鼠脾臟分離得到的淋巴細(xì)胞和外周血中 CD45+T淋巴細(xì)胞表達(dá)量：PBS組＜PBMC組＜PBMC+HUVEC組(p＜0.001)。
　　5. Q

12、-PCR檢測(cè)腫瘤組織中CD144和VEGFR2基因的表達(dá)情況：PBS組＞PBMC組＞PBMC+HUVEC組(p＜0.05)；腫瘤組織提取蛋白檢測(cè)VEGFR2和CD144的抗原表達(dá)情況：PBS組＞PBMC組＞PBMC+ HUVEC組(p＜0.05)，血清中VEGFR2和CD144抗體的表達(dá)情況：PBS組＜PBMC組＜PBMC+HUVEC組(p＜0.001)；ELISA檢測(cè)三組小鼠血清中的抗HUVEC抗體的抗性：PBS組＜PBMC組＜PBM