長鏈非編碼RNA N1LR對缺血性腦卒中后神經(jīng)元生存的作用研究.pdf

1、背景:
　　腦卒中是一類具有極高致殘率和致死率的腦血管疾病。缺血性腦卒中約占腦卒中的87％，目前尚無特效治療藥物。長鏈非編碼RNA（lncRNA）具有廣泛的生物學(xué)功能，可調(diào)控多種疾病的病理過程。但lncRNA與缺血性腦卒中的關(guān)系，目前鮮有報(bào)道。本課題組前期使用芯片技術(shù)，得到腦缺血損傷大鼠缺血半影區(qū)表達(dá)異常的lncRNA譜。本課題利用生物信息學(xué)技術(shù)，在該lncRNA譜中篩選到潛在的功能lncRNA N1LR，并在小鼠腦缺血損傷體內(nèi)外

2、模型中對其進(jìn)行功能研究。本課題豐富了lncRNA生物學(xué)功能，在lncRNA水平為缺血性腦卒中提供潛在的診治靶點(diǎn)。
　　方法:
　　制備C57小鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)模型，構(gòu)建N2a細(xì)胞氧糖剝離再灌注(OGD/R)模型，RT-qPCR法檢測N1LR在體內(nèi)外缺血再灌注損傷模型中的表達(dá)。構(gòu)建N1LR與mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖譜，預(yù)測N1LR的生物學(xué)功能。RACE法獲取N1LR全長，并用Northem blot驗(yàn)證其全長大小。通

3、過RNAi技術(shù)和過表達(dá)腺病毒構(gòu)建體內(nèi)外N1LR干擾和過表達(dá)模型，并進(jìn)行體內(nèi)外功能研究:CCK-8法檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期;RNA-FISH法對N1LR進(jìn)行神經(jīng)元亞細(xì)胞定位，神經(jīng)功能缺損評分評估神經(jīng)元損傷程度，TTC染色計(jì)算腦梗死體積，Tunel法檢測缺血半影區(qū)神經(jīng)元凋亡，尼氏染色檢測神經(jīng)元丟失。機(jī)制上，RT-qPCR檢測Nck1mRNA水平;western blot檢測p53蛋白水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測p53蛋白磷酸

4、化水平。
　　結(jié)果:
　　在缺血半影區(qū)，N1LR的表達(dá)水平在缺血0.5h最大，上調(diào)2.06倍，并隨缺血時(shí)間繼續(xù)延長而下調(diào)，缺血2h下調(diào)0.18倍;在N2a細(xì)胞OGD/R模型，N1LR的表達(dá)模式與體內(nèi)相似，N1LR的表達(dá)在復(fù)氧復(fù)糖4h后達(dá)高峰，上調(diào)3.27倍，并隨復(fù)氧復(fù)糖時(shí)間繼續(xù)延長而下調(diào)，復(fù)氧復(fù)糖16h后下調(diào)至0.28倍。沉默或過表達(dá)N1LR不影響正常N2a細(xì)胞的周期分布;N1LR過表達(dá)可致OGD/R損傷的N2a細(xì)胞G0/G

5、1期百分比下降，S期百分比升高;沉默N1LR的表達(dá)對OGD/R損傷的N2a細(xì)胞不產(chǎn)生明顯影響。N1LR過表達(dá)可顯著提高OGD/R損傷的N2a細(xì)胞的活力，抑制細(xì)胞凋亡;沉默N1LR則降低了OGD/R損傷的N2a細(xì)胞的活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。N1LR過表達(dá)降低MCAO小鼠神經(jīng)功能缺損得分，腦梗死體積縮小，并降低缺血半影區(qū)神經(jīng)元凋亡率，神經(jīng)元丟失減少;沉默N1LR則提高了MCAO小鼠神經(jīng)功能缺損得分，腦梗死體積擴(kuò)大，同時(shí)使缺血半影區(qū)神經(jīng)元凋亡率提