肝郁證模型大鼠蛋白質(zhì)組差異表達研究.pdf

1、研究背景 肝郁證，即肝氣郁結(jié)證，是中醫(yī)肝病的一個基本證型。自上世紀(jì)50年代以來，肝郁證本質(zhì)的研究一直是中醫(yī)研究領(lǐng)域的熱點，現(xiàn)已初步證實肝郁證具有現(xiàn)代病理生理學(xué)基礎(chǔ)，并部分闡釋了其中醫(yī)理論的科學(xué)性，取得了階段性成果，認(rèn)為肝郁證和機體神經(jīng)、內(nèi)分泌、循環(huán)、消化、免疫等多系統(tǒng)密切相關(guān)。到目前為止，對肝郁證的評價還處于籠統(tǒng)、多指標(biāo)、不確定狀態(tài)，有待進一步多學(xué)科綜合研究肝郁證的實質(zhì)。 隨著人類基因組計劃(HumanGenomePro

2、ject，HGP)的完成，蛋白質(zhì)組學(xué)作為后基因時代的產(chǎn)物，在生命科學(xué)研究中越來越體現(xiàn)出重要性和優(yōu)越性。中醫(yī)的證是疾病發(fā)展過程中某一階段的病機概括，具有整體性和動態(tài)性；蛋白質(zhì)組學(xué)從微觀入手，研究機體整體或某一器官、組織乃至細(xì)胞全部蛋白質(zhì)在某一時間階段的表達和功能；兩者的研究思路具有趨同性。隨之有人提出證候蛋白質(zhì)組學(xué)之說，把蛋白質(zhì)組學(xué)引入證候研究，運用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和方法，對同一疾病不同證候或同一證候不同疾病的蛋白質(zhì)組進行分析研究，也許是中

3、醫(yī)證型研究的新途徑，對了解中醫(yī)證的實質(zhì)及臨床辨證規(guī)范化具有現(xiàn)實意義。 研究目的 我們期待能從機體功能的執(zhí)行者——蛋白質(zhì)的角度，對肝郁證模型大鼠血清、肝臟組織蛋白質(zhì)組的差異表達分別進行比較分析，從動物模型的角度找到肝郁證相關(guān)的蛋白質(zhì)組群，從而為建立證候的微觀辨證指標(biāo)體系奠定基礎(chǔ)；也為從臨床疾病的角度對肝郁證相關(guān)蛋白質(zhì)組的全面研究提供技術(shù)和理論支持；并建立相關(guān)數(shù)據(jù)庫，為肝郁證本質(zhì)的闡述提供客觀依據(jù)。 研究方法

4、 本研究在肝郁證理論指導(dǎo)下，建立慢性束縛應(yīng)激肝郁證大鼠模型。運用蛋白質(zhì)組學(xué)研究中常用的二維凝膠電泳(2-DE)分離方法，結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)，同時分析模型組大鼠血清、肝組織的蛋白質(zhì)組和正常對照組大鼠之間的表達差異。2-DE分離中涉及到血清蛋白質(zhì)組學(xué)和組織蛋白質(zhì)組學(xué)。 1、慢性束縛應(yīng)激肝郁證大鼠模型的建立 參照相關(guān)文獻報道，從慢性心理應(yīng)激的角度出發(fā)，將16只wistar大鼠隨

5、機分為模型和正常對照組，每組各8只。模型組大鼠單籠飼養(yǎng)，將大鼠束縛于可根據(jù)個體大小調(diào)節(jié)的束縛籠，造成模型大鼠不能自由活動，每天6小時，造模為期3周；正常對照組大鼠不予任何干預(yù)，群養(yǎng)。 2、蛋白質(zhì)樣本的提取和樣本混合 從全血中低溫離心分離出的血清可直接用于2-DE分離。以液氮研磨肝臟組織，低溫裂解肝細(xì)胞，再高速低溫離心分離脂質(zhì)和細(xì)胞碎片的方法，提取肝組織蛋白質(zhì)樣本。采用CoomassiebrilliantblueG250法

6、對蛋白質(zhì)樣本定量。對組內(nèi)血清和肝組織蛋白質(zhì)樣本，分別按等質(zhì)量進行樣本混合。 3、血清和肝組織蛋白質(zhì)組的2-DE分離 基于血清中蛋白質(zhì)成份復(fù)雜、濃度動態(tài)范圍大等特點，對血清蛋白質(zhì)2-DE分離中的許多技術(shù)條件加以優(yōu)化處理。建立“鹽橋”，結(jié)合低電壓除鹽法，促進2-DE分離中的有效聚焦；以窄范圍PH梯度IPG干膠條增強低豐度蛋白的分離效果。通過對上述技術(shù)的改良，建立起更穩(wěn)定，重復(fù)性好的血清蛋白質(zhì)組2-DE分離方法。在常規(guī)組織蛋白

7、質(zhì)組2-DE分離技術(shù)基礎(chǔ)上，引入“鹽橋”和低電壓除鹽方法，進一步優(yōu)化肝組織蛋白質(zhì)組2-DE分離技術(shù)。對同類混合樣本以組間配對的形式，同時進行2-DE分離，并重復(fù)3次。 4、凝膠染色和圖像分析 對2-DE分離所獲得的凝膠，采用新型膠體考染技術(shù)，在提高凝膠染色的靈敏度的同時，減少對后期質(zhì)譜檢測的干擾。經(jīng)染色和脫色以光密度透射掃描儀掃描形成圖像。用ImageMaster2DElite軟件分析凝膠圖像，獲取每個蛋白質(zhì)的表達量、分

8、子量、等電點等信息。設(shè)定在組間表達量相差2倍以上的蛋白質(zhì)斑點為差異表達蛋白質(zhì)，分析結(jié)果由軟件自動生成，人工加以驗證。 5、差異表達蛋白質(zhì)斑點質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫確認(rèn) 以MALDI-TOF-MS對軟件分析所獲得的差異蛋白質(zhì)斑點進行肽質(zhì)量指紋(peptidemassfingerprint，PMF)檢測。首先，在凝膠上切取差異表達蛋白質(zhì)斑點，再經(jīng)水洗、脫色、還原與烷基化、酶解、萃取、點樣和質(zhì)譜分析等步驟獲取每個蛋白質(zhì)斑點的PMF。

9、然后，利用Mascot軟件搜索各大生物和蛋白質(zhì)相關(guān)數(shù)據(jù)庫，尋找與目的PMF相匹配的蛋白質(zhì)，并查詢該蛋白質(zhì)的相關(guān)信息。 結(jié)果 1、造模3周后，模型組大鼠主要表現(xiàn)為毛色黯淡、易于脫落，活動、飲食量減少，喜歡貼壁，叫聲尖細(xì)、胡須下垂、反應(yīng)遲緩等。 2、獲得了高質(zhì)量的血清和肝組織蛋白質(zhì)組2-DE凝膠電泳圖像。改良后的血清2-DE分離方法，即便在不去除高豐度蛋白的條件下也能達到較理想的蛋白分離效果，避免了去除高豐度蛋白所帶

10、來的蛋白丟失。該方法在大鼠和人體血清的蛋白質(zhì)2-DE分離中均具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，也可推廣用于組織蛋白質(zhì)組的2-DE技術(shù)優(yōu)化。 3、經(jīng)2-DE分離和對凝膠圖像的軟件分析，篩選出具有明顯表達差異的9個血清蛋白質(zhì)斑點和3個肝組織蛋白質(zhì)斑點。模型大鼠血清中的9個蛋白質(zhì)均表達下調(diào)，肝組織中的2個蛋白質(zhì)表達上調(diào)，1個為表達下調(diào)。 4、差異蛋白質(zhì)斑點的質(zhì)譜檢測，出峰率達100％，經(jīng)對PMF的分析和數(shù)據(jù)庫檢測，確定在肝郁證大鼠模型

11、中表達具有明顯差異的6個血清蛋白質(zhì)和3個肝組織蛋白質(zhì)。它們分別為轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)、Bal-647、白蛋白前體、Igλ-2鏈C區(qū)、乙酰膽堿受體抗體Fab片段和烯酰輔酶A水合酶、芳基硫基轉(zhuǎn)移酶；TTR在血清和肝臟中的表達均有差異。 結(jié)論 首次對肝郁證慢性束縛應(yīng)激動物模型進行蛋白質(zhì)組的研究，通過分析模型大鼠血清、肝組織蛋白質(zhì)組的差異表達，獲得和肝郁證動物模型密切相關(guān)的9個差異表達蛋白質(zhì)。這些蛋白主要涉及機體免疫、神經(jīng)、