FoxN1、GDF11及Exosome在免疫系統(tǒng)老化與抗老化中的作用.pdf

1、目的：
　　免疫系統(tǒng)發(fā)育異常及免疫系統(tǒng)的老化是許多老年相關(guān)性疾病、惡性腫瘤、心血管疾病及神經(jīng)退行性疾病的重要發(fā)病原因。大量的研究表明FoxN1基因表達(dá)對(duì)免疫系統(tǒng)中的胸腺發(fā)育及T細(xì)胞生成具有關(guān)鍵作用。FoxN1主要表達(dá)在皮膚以及胸腺的上皮細(xì)胞(TECs)，對(duì)皮膚以及胸腺的上皮細(xì)胞發(fā)育起重要作用。先天的FoxN1基因變異會(huì)導(dǎo)致胸腺的上皮細(xì)胞(TECs)的發(fā)育障礙，出生后FoxN1基因表達(dá)過(guò)低導(dǎo)致胸腺萎縮，T淋巴細(xì)胞生成能力降低。Fox

2、N1的表達(dá)隨著年齡的增大而降低，F(xiàn)oxN1在老年個(gè)體中表達(dá)極微弱。因此我們通過(guò)內(nèi)源性途徑構(gòu)建了FoxN1基因過(guò)表達(dá)小鼠來(lái)研究FoxN1基因過(guò)表達(dá)能否促進(jìn)免疫系統(tǒng)的發(fā)育以及能否促進(jìn)老化萎縮的胸腺再生。另外一些科研團(tuán)隊(duì)在年輕個(gè)體的血液中發(fā)現(xiàn)了循環(huán)因子能有效逆轉(zhuǎn)組織老化。在老年小鼠模型中注射年輕的循環(huán)因子能有效改善老年骨骼肌、神經(jīng)系統(tǒng)以及心肌系統(tǒng)的干細(xì)胞微環(huán)境，從而提高老化組織的干細(xì)胞再生能力使得這些老化的器官系統(tǒng)再生。這些環(huán)境循環(huán)因子可能是

3、生長(zhǎng)因子例如GDF11，或者可能是能調(diào)節(jié)基因表達(dá)的micro-RNA。因此我們通過(guò)外源性途徑注射環(huán)境循環(huán)因子GDF11和Exosome研究其能否有效地逆轉(zhuǎn)老化的免疫系統(tǒng)，并且減輕老年個(gè)體的慢性炎癥反應(yīng)，從而有效地發(fā)揮抗老化作用。
　　方法：
　　一、FoxN1基因條件性過(guò)表達(dá)小鼠構(gòu)建
　　1.利用質(zhì)粒重構(gòu)等基因工程技術(shù)構(gòu)建Rosa26-STOPflox-FoxN1轉(zhuǎn)基因小鼠;
　　2.利用western blot

4、和Southern Blot技術(shù)對(duì)構(gòu)建后基因靶條帶進(jìn)行鑒定;
　　3.利用雜交技術(shù)獲得多種不同的FoxN1條件性過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　二、FoxN1基因過(guò)表達(dá)對(duì)免疫系統(tǒng)的發(fā)育的影響
　　1.采HE染色方法檢測(cè)K14CreERT介導(dǎo)的FoxN1基因過(guò)表達(dá)小鼠的皮膚結(jié)構(gòu);
　　2.采用免疫熒光染色技術(shù)分析FoxN1TguCreERT小鼠的胸腺結(jié)構(gòu)，并通過(guò)細(xì)胞流式分析確定FoxN1TguCreERT小鼠胸腺皮質(zhì)/髓質(zhì)

5、的比例;
　　3.采用細(xì)胞流式染色分析胸腺T細(xì)胞各亞群的發(fā)育以及外周T細(xì)胞的功能活性;
　　4.采用Realtime-PCR分析FoxN1Tg在骨髓異位表達(dá)情況，并通過(guò)細(xì)胞流式分析FoxN1Tg在骨髓異位表達(dá)對(duì)骨髓及脾臟B細(xì)胞發(fā)育的影響;
　　三、外源性途徑注射環(huán)境循環(huán)因子GDF11和Exosome后能否有效地逆轉(zhuǎn)老化的免疫系統(tǒng)
　　1.通過(guò)對(duì)老年小鼠腹腔注射GDF11和Exosome，采用流式細(xì)胞術(shù)分析GDF1

6、1和Exosome對(duì)外周T細(xì)胞功能的影響;
　　2.采用Elisa分析外周血中炎癥反應(yīng)情況;
　　3.采用流式細(xì)胞術(shù)分析外周脾臟中炎癥反應(yīng)情況;
　　4.采用Realtime-PCR分析胸腺中的炎癥反應(yīng)情況。
　　結(jié)果：
　　一、通過(guò)內(nèi)源性途徑構(gòu)建FoxN1基因過(guò)表達(dá)小鼠
　　1.利用基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了Rosa26-STOPflox-FoxN1轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　2.將Rosa26-STOPf

7、lox-FoxN1轉(zhuǎn)基因小鼠與uCreERT、K14CreERT以及K5CreERT小鼠雜交，獲得三種不同的FoxN1基因過(guò)表達(dá)小鼠。
　　二、FoxN1基因過(guò)表達(dá)能否促進(jìn)免疫系統(tǒng)的發(fā)育以及能否促進(jìn)老化萎縮的胸腺再生
　　1.K14Cre+介導(dǎo)的新生FoxN1過(guò)表達(dá)小鼠存在皮膚滲透性增加以及喂養(yǎng)方面缺陷導(dǎo)致其出生后24小時(shí)內(nèi)死亡;
　　2.uCreERT介導(dǎo)的FoxN1過(guò)表達(dá)對(duì)幼年期胸腺發(fā)育成熟有不利的影響，并且導(dǎo)致外

8、周T淋巴細(xì)胞功能退化;
　　3.幼年小鼠通過(guò)uCreERT調(diào)節(jié)外源FoxN1Tg在骨髓異位表達(dá)，影響B(tài)細(xì)胞的發(fā)育;
　　4.K5CreERT介導(dǎo)FoxN1過(guò)表達(dá)影響幼年小鼠胸腺和皮膚的發(fā)育，但對(duì)成年小鼠無(wú)不良影響;
　　三、外源性途徑注射環(huán)境循環(huán)因子GDF11和Exosome后能否有效地逆轉(zhuǎn)老化的免疫系統(tǒng)
　　1.年輕系統(tǒng)性環(huán)境循環(huán)因子GDF11和Exosome能逆轉(zhuǎn)老化的T細(xì)胞免疫系統(tǒng)，促使老化萎縮的胸腺增大，

9、T細(xì)胞生成能力提高，外周T細(xì)胞活性增強(qiáng);
　　2.年輕系統(tǒng)性環(huán)境循環(huán)因子GDF11和Exosome能減輕老年個(gè)體存在的慢性炎癥反應(yīng);
　　3.老年小鼠Exosome注射后胸腺內(nèi)GDF11表達(dá)升高，提示Exosome可能是GDF11的上游調(diào)節(jié)因子，通過(guò)促進(jìn)GDF11表達(dá)而發(fā)揮抗老化作用。
　　結(jié)論：
　　1.早期異位表達(dá)及大量過(guò)表達(dá)FoxN1基因會(huì)影響胸腺上皮細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞以及皮膚上皮細(xì)胞的發(fā)育，損害了免疫系