豚鼠過敏性休克組織中相關介質的表達及法醫(yī)學意義.pdf

1、前言: 過敏性休克(anaphylactic shock)屬于速發(fā)型變態(tài)反應，是IgE介導的Ⅰ型變態(tài)反應中最為危重與急驟的一種。過敏性休克可以出現皮膚、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及心血管系統(tǒng)的癥狀和體征，嚴重者可以導致患者死亡，經常引起醫(yī)療糾紛和民事訴訟。 過敏性休克死亡尸體常無特異性病理學改變，其法醫(yī)學診斷也缺乏明確的客觀指標。過敏性休克的發(fā)生是由于肥大細胞脫顆粒所釋放的各種介質發(fā)揮其作用生物學所致。類胰蛋白酶(trypta

2、se)和胃促胰酶(chymase)是肥大細胞中兩種中性絲氨酸蛋白酶，其分子量大于其他致過敏性反應的介質，且其理化性質穩(wěn)定，因此，類胰蛋白酶和胃促胰酶被認為是肥大細胞脫顆粒的重要標志。 白細胞介素5(IL-5)是嗜酸性粒細胞(EOS)趨化因子之一，是Ⅰ型變態(tài)反應中主要的效應因子。組織中IL-5的表達主要限于哮喘的研究，而關于過敏性休克發(fā)生后IL-5在體內的表達情況，尚缺乏深入的研究。 本研究在建立豚鼠過敏性休克的動物模型基

3、礎上，應用免疫組織化學技術，觀察人混合血清致豚鼠過敏性休克死亡體內多臟器組織中類胰蛋白酶、胃促胰酶和IL-5的表達情況，通過病理學觀察和統(tǒng)計學分析，并結合《醫(yī)療事故處理條例》所規(guī)定的保存條件，來評定這三種介質在過敏性休克診斷中的意義，為過敏性休克死亡的法醫(yī)學鑒定提供形態(tài)學依據和指標。 材料和方法: 一、動物模型的建立及分組 健康成年豚鼠24只，隨機分為死亡即時組、冷藏48小時組和冷凍7天組，每組8只，每組又分實驗

4、組和對照組，每組4只。實驗組應用人混合血清誘發(fā)豚鼠發(fā)生過敏性休克死亡；對照組豚鼠采用生理鹽水代替血清，乙醚麻醉過量致死，提取兩組豚鼠心血制備血清備檢，取喉頭、氣管、雙肺、胃等器官，4％多聚甲醛固定，石蠟包埋。準備明確過敏性休克死亡和非過敏性休克死亡實際案例各5例進行初步探索性觀察研究. 二、實驗方法 1、應用HE染色法觀察組織的形態(tài)學特點； 2、采用鉻變素2R染色法觀察組織中嗜酸性粒細胞浸潤情況； 3、使

5、用化學發(fā)光法檢測血清中IgE水平： 4、應用免疫組織化學染色法觀察類胰蛋白酶、胃促胰酶和IL-5在組織中的表達情況； 5、使用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)計算免疫組織化學染色陽性細胞數及表達面積； 6、應用SPSS統(tǒng)計學軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析。 實驗結果: 1、HE染色見過敏性休克的豚鼠喉頭、氣管等器官水腫，肺泡擴張，肺泡壁變?。?2、鉻變素2R染色后

6、見實驗組各臟器組織內較多嗜酸性粒細胞浸潤； 3、實驗組血清IgE水平明顯高于對照組； 4、對照組各組可見散在類胰蛋白酶和胃促胰酶免疫組織化學染色陽性的肥大細胞，細胞形態(tài)完整，染色產物分布于細胞胞漿內，呈棕黃色。實驗組類胰蛋白酶和胃促胰酶染色陽性細胞增多，表達增強，而且染色產物部分彌散到肥大細胞周圍及組織間隙；對照組可見散在IL-5陽性細胞，染色產物位于胞漿內。實驗組IL-5陽性細胞形態(tài)不完整，染色產物大部分彌散到細胞周圍

7、和組織間隙。使用Motic Image Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)計算各組免疫組織化學陽性染色面積，通過SPSS軟件統(tǒng)計分析，發(fā)現實驗組和對照組在相同保存條件下仍然存在較大差異； 5、實際案例中非過敏性休克死亡者類胰蛋白酶和胃促胰酶免疫組織化學染色陽性顆粒出現于肥大細胞胞漿內，肥大細胞形態(tài)完整；過敏性休克死亡者大部分免疫組織化學染色產物彌散至肥大細胞周圍和組織間隙，肥大細胞形態(tài)不規(guī)則。 討論: 過敏性休

8、克是臨床上常見的一種速發(fā)型變態(tài)反應，主要是由IgE介導，為Ⅰ型變態(tài)反應中最為危重與急驟的一種，?？蓪е禄颊哜溃虼?，在法醫(yī)學鑒定工作中經常接觸到。 過敏性休克的發(fā)生是由于個體在接受變應原刺激后，產生IgE類抗體，當相應的抗原再次進入機體時通過與致敏肥大細胞表面的兩個或兩個以上相鄰IgE抗體特異結合，使膜表面的FcεRI(FC受體)交聯活化，最終導致肥大細胞脫顆粒，從而引發(fā)過敏性休克的各種臨床征象。 過敏性休克死亡者，心

9、血中IgE的濃度往往增高，組織中嗜酸性粒細胞數量增多。但IgE受外界因素影響較大，嗜酸性粒細胞也不是過敏性休克所特有，缺乏一定的客觀性。 過敏性休克發(fā)生的一個重要機制是肥大細胞脫顆粒，釋放介質引起相應的癥狀和體征。如何證明肥大細胞脫顆粒是診斷過敏性休克的關鍵問題。類胰蛋白酶和胃促胰酶是肥大細胞內兩種重要的絲氨酸蛋白酶，同時它們的性質非常穩(wěn)定，肥大細胞發(fā)生脫顆粒時它們也會隨之脫出到細胞外和組織間隙中。IL-5是嗜酸性粒細胞趨化因子

10、，在嗜酸性粒細胞增多的疾病中，其表達將會增強。本實驗通過對實驗組和對照組不同保存條件下類胰蛋白酶、胃促胰酶和IL-5進行免疫組織化學染色觀察，證實了這3種介質在過敏的豚鼠體內表達增強，類胰蛋白酶和胃促胰酶也明顯地反映出肥大細胞脫顆?，F象。因此，類胰蛋白酶、胃促胰酶和IL-5的免疫組織化學染色可以為過敏性休克的診斷提供新的形態(tài)學依據。 本實驗將所使用的類胰蛋白酶和胃促胰酶免疫組織化學染色法應用于實際案例中，結果表明非過敏性休克死亡

11、的標本兩種蛋白酶表達的情況反映出肥大細胞的數量和形態(tài)，而過敏性休克死亡的標本內兩種酶表達增強，染色產物脫出于肥大細胞外及周圍組織間隙，肥大細胞形態(tài)不規(guī)則，因此，類胰蛋白酶和胃促胰酶的免疫組織化學染色法有望應用于過敏性休克的法醫(yī)學實際案例的診斷。 結論: 1、HE染色見過敏性休克的豚鼠喉頭、氣管等器官水腫，肺泡擴張，肺泡壁變??； 2、過敏性休克的豚鼠臟器經過鉻變素2R染色后，各臟器內出現了明顯的嗜酸性粒細胞浸潤情況

12、； 3、過敏性休克豚鼠血清IgE水平明顯高于對照組； 4、過敏性休克的豚鼠體內類胰蛋白酶、胃促胰酶及IL-5的表達增強，可以為過敏性休克的診斷提供形態(tài)學依據； 5、按國務院頒布的《醫(yī)療事故處理條例》實施細則規(guī)定的死亡后冷藏48小時或冷凍7天內進行尸檢的條件標準，在以上兩種條件下進行這三種介質的免疫組織化學染色，不影響它們的表達以及對其結果的判定； 6、本實驗類胰蛋白酶和胃促胰酶免疫組織化學染色方法有望應用