高糖高脂日糧對(duì)團(tuán)頭魴生長性狀、肝組織結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄組的影響.pdf

1、團(tuán)頭魴是中國重要的淡水草食性混養(yǎng)魚類之一。近年來，如何最大限度地利用非蛋白能量飼料及其在飼料中如何正確配比等問題已有較多研究與報(bào)道。非蛋白能量飼料的過量使用可以造成魚類體脂的大量沉積，從而導(dǎo)致魚類脂肪肝疾病。然而迄今為止，有關(guān)非蛋白能量飼料過量使用導(dǎo)致團(tuán)頭魴脂肪肝疾病發(fā)生的相關(guān)報(bào)道較少。通常情況下，魚類攝食是由餌料能量及營養(yǎng)成分等因素協(xié)同調(diào)節(jié)影響魚類健康，而魚類健康又與相關(guān)功能基因的表達(dá)有關(guān)，類似的研究已在其它魚類中獲得證實(shí)，如虹鱒、金

2、鯧等。團(tuán)頭魴該方面的相關(guān)研究，主要集中在碳水化合物與脂肪飼料對(duì)團(tuán)頭魴生長性能及免疫機(jī)制改善等方面的研究，而由于日糧中高糖高脂導(dǎo)致團(tuán)頭魴脂肪沉積所產(chǎn)生的生長性能和肝組織改變，以及其變化后的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征未見報(bào)道。因此，本文以團(tuán)頭魴為研究對(duì)象，經(jīng)過8周高糖高脂日糧的飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，利用組織切片與轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法來研究高脂日糧(HFD，脂肪含量12.22％)、高糖日糧（HCBD，還原糖含量34.13％）和高脂高糖日糧(HFHCD，脂肪含量10.43％,

3、還原糖含量30.80％)對(duì)團(tuán)頭魴生長性能、肝組織及肝轉(zhuǎn)錄組的影響，并在此基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR、血液生化指標(biāo)及部分肝臟與血液代謝組的結(jié)果，通過不同日糧處理間的比較分析，揭示高糖、高脂日糧如何對(duì)團(tuán)頭魴的肝臟和線粒體代謝產(chǎn)生影響，其主要結(jié)果如下:
　　1、不同實(shí)驗(yàn)組團(tuán)頭魴生長性能與肝組織學(xué)特征比較
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各組團(tuán)頭魴的存活率均大于94％，且差異不顯著(p＞0.05)。HFD組終體重最高，其體增重顯著高于對(duì)照組(p＜0

4、.05），但與HCD及HFHCD組差異不顯著(p＞0.05)。對(duì)照組的餌料系數(shù)(FCR)、特定生長率(SGR)均與HFD及HFHCD組差異顯著(p＜0.05)，與HCBD組差異不顯著(p＞0.05)，且HFD組的FCR、SGR的效果最好。對(duì)照組與HFD及HCBD組間的肝體指數(shù)(HSI)存在顯著性差異(p＜0.05)，而HFHCD與對(duì)照組、HFD組間無顯著性差異(p＞0.05)，其中HFD組最小，HCBD最大。肝臟組織切片結(jié)果與肝體指數(shù)變

5、化趨勢(shì)一致。對(duì)照組中肝臟表現(xiàn)為常規(guī)肝細(xì)胞形狀，細(xì)胞質(zhì)大，細(xì)胞核位于胞質(zhì)中央，有少量脂肪滴。而HFD、HCBD及HFHCD組中肝臟組織學(xué)特征顯示細(xì)胞中脂肪沉積較多，細(xì)胞核偏移，空泡較多，中央靜脈處皮質(zhì)細(xì)胞異常，肝細(xì)胞腫大，有炎癥等，脂肪肝癥狀明顯。上述結(jié)果表明，高糖、高脂日糧可以提高團(tuán)頭魴的生長性能，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致脂肪在肝細(xì)胞中的沉積，進(jìn)而影響肝細(xì)胞健康。
　　2、不同實(shí)驗(yàn)組團(tuán)頭魴的轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較
　　為進(jìn)一步了解投喂高糖、高脂日

6、糧實(shí)驗(yàn)后，團(tuán)頭魴轉(zhuǎn)錄組學(xué)的變化，本實(shí)驗(yàn)采用Solexa/Illumina方法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。采集四個(gè)處理(對(duì)照、HFD、HCBD、HFHCD)的樣本，構(gòu)建了12個(gè)cDNA文庫。測序、組裝后共獲得96，249個(gè)Unigenes（平均長度5.1Gb），并進(jìn)行了功能注釋，基于Nr數(shù)據(jù)庫的比對(duì)，與團(tuán)頭魴Unigenes序列相似性最高的魚類是斑馬魚(86％)。部分基因(n=42，563)比對(duì)結(jié)果主要分為三大類，即生物學(xué)過程(14，583Unige

7、nes)，細(xì)胞組分(11，271Unigenes)及分子功能(14，901Unigenes)。KEGG通路比較分析發(fā)現(xiàn)，HFD、HCBD及HFHCD三組間分別有2，146、1，895及2，210個(gè)差異Unigenes，共獲得323，319Unigenes和324個(gè)通路。在已鑒定出來的表達(dá)基因中發(fā)現(xiàn)，分別有1339，1318，1907個(gè)上調(diào)基因和4568，4238，4799下調(diào)基因。本研究結(jié)果拓展了本文對(duì)日糧中高糖、高脂影響團(tuán)頭魴脂肪肝病

8、變化過程的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步深入揭示團(tuán)頭魴脂質(zhì)代謝過程提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　3、高糖日糧對(duì)團(tuán)頭魴肝臟健康的負(fù)面影響:
　　與肥胖相關(guān)的高碳水化合物攝入是人類脂肪肝病產(chǎn)生的主要原因之一，本實(shí)驗(yàn)探討了高碳水化合物的攝入是如何影響團(tuán)頭魴肝臟健康。轉(zhuǎn)錄組及實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在HCBD組中，高碳水化合物會(huì)顯著上調(diào)胰島素信號(hào)通路與非酒精性脂肪肝(NAFLD)通路中的INSR、IRS、PI3K、PDK、AKT、ACC、

9、IL6、AP1、ChREBP-MLX、PEPCK及FBP等基因(p＜0.05)，而顯著性下調(diào)SOCS3、GSK3β和AMPK基因(p＜0.05)，這些基因表達(dá)的改變可導(dǎo)致肝細(xì)胞胰島素的抵抗、肝臟病理變化、甚至NAFLD的形成。代謝組學(xué)結(jié)果顯示，高碳水化合物攝入可顯著增加血漿中α/β-葡萄糖，琥珀酸鹽和酪氨酸水平，從而增加肝糖原和甘油三酯含量;同時(shí)，HCBD組肝臟中維持肝功能正常的關(guān)鍵代謝物之一的甜菜堿含量水平顯著降低(p＜0.05)。血

10、液生化分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清中高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)以及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)表達(dá)顯著增加(p＜0.05)。這些結(jié)果與之前的肝體指數(shù)、肝組織切片結(jié)果一致，即肝臟代謝異常，其脂質(zhì)過度積聚，肝臟受損。因此，轉(zhuǎn)錄組、代謝組、血液生化指標(biāo)及組織學(xué)結(jié)果均表明高碳水化合物會(huì)導(dǎo)致團(tuán)頭魴肝損傷的早期癥狀，該研究擴(kuò)展了本文對(duì)于高碳水化合物如何導(dǎo)致團(tuán)頭魴肝臟脂肪沉積以及血漿中α/β-葡萄糖的上升與甜菜堿的降低的認(rèn)知。

11、但是，經(jīng)過更長時(shí)間的飼養(yǎng)試驗(yàn)是否最終會(huì)導(dǎo)致NAFLD的形成仍有待進(jìn)一步研究。
　　4、高糖高脂日糧對(duì)團(tuán)頭魴肝臟線粒體代謝的影響
　　轉(zhuǎn)錄組GO（包括分子功能、細(xì)胞組分和生物學(xué)過程）分析表明，其中細(xì)胞組分中有大量差異表達(dá)基因(DEGs)與線粒體代謝有關(guān)。KEGG分析顯示（2210個(gè)DEGs與KEGG數(shù)據(jù)庫中的324個(gè)代謝路徑相比對(duì)），與人類疾病相關(guān)的DEGs數(shù)量最多（達(dá)831個(gè)），其中與神經(jīng)退行性疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ习Y、亨廷頓

12、氏舞蹈癥和帕金森癥等）相關(guān)的DEGs數(shù)量最高(239個(gè))，通過KEGG通路富集進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，顯著性最高的相關(guān)代謝通路依次為帕金森癥、氧化磷酸化、阿爾茨海默氏癥及亨廷頓氏舞蹈癥。此外，與第4章結(jié)果相似，NAFLD通路中也有許多DEGs，這可能是高糖高脂日糧導(dǎo)致線粒體代謝紊亂的結(jié)果，因?yàn)榫€粒體在真核生物生理代謝中具有重要作用，其功能紊亂是導(dǎo)致代謝疾病和神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的關(guān)鍵因子。
　　為了進(jìn)一步探討高糖高脂日糧與線粒體功能紊亂及神

13、經(jīng)退行性疾病之間的關(guān)系，本文通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測了17個(gè)與線粒體代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，在HFHCD組中，基因FATP、FABP、ChREBP均顯著升高(p＜0.05)，表明脂肪酸的攝入、運(yùn)輸及合成均增加;但PPARα和PPARγ顯著降低(p＜0.05)、PPARβ顯著升高(p＜0.05)，同時(shí)線粒體脂肪酸β氧化中CPTⅠ和CPTⅡ的表達(dá)顯著上調(diào)(p＜0.05)，表明脂質(zhì)分解代謝增加，與前面及預(yù)期的結(jié)果不同，這

14、可能是由于魚類更傾向于將過剩的能量貯存為蛋白質(zhì)，或是魚類PPARs功能與哺乳動(dòng)物不同的原因，也可能是高糖高脂日糧導(dǎo)致線粒體代謝功能紊亂的體現(xiàn)。而氧化磷酸化中的關(guān)鍵基因CXⅠ、CXⅡ、CXⅢ、CXⅤ、cytc與超氧化物歧化酶SOD2被顯著下調(diào)(p＜0.05)，其原因可能是魚體為了應(yīng)對(duì)高營養(yǎng)負(fù)荷，許多不同類型細(xì)胞中的ATP和NADH水平增加，代謝平衡轉(zhuǎn)向脂質(zhì)和糖原貯存，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體生物合成被下調(diào)。因此，日糧能量過剩（如高糖高脂日糧）會(huì)導(dǎo)致