Stx2噬菌體ФMin27溶原影響宿主大腸桿菌的分子機制.pdf

1、大腸桿菌O157為重要的食源性病原菌，其主要毒力因子之一是志賀毒素（Shiga toxin），編碼志賀毒素的噬菌體為志賀毒素噬菌體（Stx噬菌體）。Stx噬菌體的溶原可使宿主菌產(chǎn)生Stx毒素，導(dǎo)致細菌致病力增強。此外 Stx噬菌體溶原與宿主菌之間還會產(chǎn)生哪些相互影響還不是很清楚。本研究以Stx2噬菌體ΦMin27為研究對象，試圖揭示Stx2噬菌體溶原與宿主菌之間的相互調(diào)控作用，為防控產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌特別是大腸桿菌O157提供一定的理論

2、依據(jù)。
　　1. Stx2噬菌體溶原感染對宿主大腸桿菌MG1655蛋白表達的影響
　　通過噬菌體溶原感染和二維電泳（2-Dimensional electrophoresis，2DE）研究Stx2噬菌體ΦMin27溶原對大腸桿菌MG1655蛋白表達的影響。采用雙層瓊脂法及PCR技術(shù)驗證獲得穩(wěn)定的純化溶原株 MG1655ФMin27。采用二維電泳技術(shù)，對野生株MG1655和溶原株MG1655ФMin27在相同生長條件下的全蛋白

3、表達譜進行了比較，結(jié)果顯示蛋白表達出現(xiàn)差異的點有65個，選擇其中的32個差異點進行了質(zhì)譜鑒定（LC-MS/MS），其中有四種蛋白均與F eS合成亞單位相關(guān)，即NfuA、FdoH、SdhB和 FtnA蛋白。為進一步論證二維電泳檢測結(jié)果的可靠性，選擇了大腸桿菌的4個差異表達蛋白基因（nfuA、fdoH、sdhB和 ftnA）進行熒光定量 PCR（RT-PCR）驗證，分析結(jié)果與全蛋白二維電泳得到的結(jié)果一致。本研究探索了噬菌體ΦMin27溶原感

4、染前后大腸桿菌宿主MG1655蛋白表達的變化，為進一步了解噬菌體與宿主菌的相互作用提供了參考數(shù)據(jù)。
　　2. nfuA、fdoH、sdhB和ftnA基因缺失株及其溶原株的構(gòu)建以及鐵離子對其生長特性的影響
　　在二維電泳和蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果中，有四個差異表達蛋白NfuA、FdoH、SdhB和FtnA均與FeS合成亞單位相關(guān)，為此進一步探索其在Stx噬菌體溶原中的作用及鐵離子代謝對噬菌體溶原產(chǎn)生的影響。利用λ噬菌體的Red重組系統(tǒng)

5、，構(gòu)建了大腸桿菌 MG1655的缺失株 MG1655△nfuA、MG1655△fdoH、MG1655△sdhB和MG1655△ftnA，并將nfuA片段、fdoH片段、sdhB片段和ftnA片段與pUC18質(zhì)粒連接，然后分別轉(zhuǎn)化入相應(yīng)的突變株，得到相應(yīng)的互補菌株。將Stx2噬菌體ΦMin27感染各缺失突變株，獲得相應(yīng)的溶原菌株。
　　隨后測定了野生株、溶原株、缺失株和互補株分別在普通 LB液體培養(yǎng)基及缺鐵（添加鐵螯合劑2，2’-聯(lián)

6、吡啶（DPD））和富鐵（添加FeCl3）狀態(tài)下的生長曲線，研究鐵離子對各菌株生長的影響。結(jié)果表明在普通LB液體培養(yǎng)基中，nfuA及sdhB基因缺失對MG1655的生長抑制較大，fdoH及ftnA缺失株溶原前后生長曲線無明顯差異，nfuA缺失株溶原后菌株生長要稍稍滯后于未溶原株，而 sdhB缺失突變株溶原 Stx2噬菌體ΦMin27后菌株生長顯著快于未溶原株。250μM DPD和500μM FeCl3對野生株MG1655的生長無顯著影響。

7、在缺鐵條件下（250μM DPD），fdoH和ftnA缺失株與野生株生長無明顯差異，但nfuA和sdhB缺失株對鐵離子缺乏比較敏感。在相應(yīng)的ΦMin27噬菌體溶原株中，fdoH和ftnA缺失溶原株與野生株在缺鐵（250μM DPD）和富鐵（500μM FeCl3）條件下的生長均無明顯差異。然而，不論是在普通 LB肉湯中還是在缺鐵或富鐵環(huán)境中，sdhB缺失溶原株（MG1655△sdhBΦMin27）均比野生溶原株（MG1655ΦMin27

8、）生長更好。相反地，nfuA缺失溶原株（MG1655△nfuAΦMin27）在普通 LB肉湯中比野生溶原株（MG1655ΦMin27）生長要慢，補充Fe3+可彌補這種生長差異。而鐵螯合劑DPD的添加會促進這種生長差異，且DPD濃度越大，nfuA缺失溶原株生長抑制越明顯，可見nfuA在噬菌體溶原株中發(fā)揮了重要作用。
　　3.大腸桿菌nfuA在Stx2噬菌體ΦMin27溶原穩(wěn)定性中的作用
　　為進一步探索大腸桿菌nfuA在Stx

9、噬菌體溶原菌中所發(fā)揮的作用，對nfuA突變?nèi)茉赀M行進一步的研究。為驗證nfuA缺失溶原株是否發(fā)生了噬菌體自發(fā)誘導(dǎo)，在噬菌體未誘導(dǎo)狀態(tài)下檢測了溶原菌培養(yǎng)上清液中噬菌體以及 Stx2毒素。結(jié)果顯示，缺鐵條件下（250μM DPD），存在于nfuA缺失溶原株培養(yǎng)上清液中的噬菌體達到了106 PFU/m l以上，顯著高于野生溶原株和其他突變?nèi)茉?。相?yīng)地，在Stx2對Vero細胞的毒性檢測中，nfuA缺失溶原株上清液中的Stx2毒性也明顯高于

10、其他各突變?nèi)茉?。同時對大腸桿菌O157:H7 Min27進行了nfuA基因缺失株的構(gòu)建，并檢測了其培養(yǎng)上清液中噬菌體以及Stx2，得到了一致的結(jié)果。為了驗證噬菌體是否進入了裂解周期，采用qRT-PCR檢測了與裂解周期相關(guān)的調(diào)控蛋白編碼基因cI、cII、cIII和cro在nfuA缺失和缺鐵條件下的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示：在鐵螯合劑DPD（250μM）存在條件下，與野生溶原株相比，nfuA缺失溶原株cro基因表達水平上調(diào)了9倍以上，c

11、I、cII和cIII基因表達水平下調(diào)了5～20倍。因此，nfuA的缺失影響了與噬菌體溶原生命周期相關(guān)的基因表達，促使噬菌體進入了裂解周期，在缺鐵條件下，這種現(xiàn)象更為顯著。推測nfuA在維持噬菌體溶原中發(fā)揮了極其重要的作用，可維持菌株中的噬菌體保持溶原狀態(tài)。
　　4. Stx2噬菌體溶原對大腸桿菌運動性及其相關(guān)基因表達的影響
　　本實驗通過基因缺失和噬菌體溶原轉(zhuǎn)換研究大腸桿菌運動相關(guān)基因flhDC、fliA、fliD和fliE

12、對Stx2噬菌體ΦMin27溶原菌的影響。同時利用Red重組酶系統(tǒng)，構(gòu)建了大腸桿菌 MG1655的缺失株 MG1655△flhDC、MG1655△fliA、MG1655△fliD及MG1655△fliE，并將目的片段分別與pUC18質(zhì)粒連接，然后分別轉(zhuǎn)化入相應(yīng)的突變株，得到相應(yīng)的互補菌株。通過Stx2噬菌體ΦMin27的感染獲得各缺失株的溶原株。隨后測定了各菌株的運動能力，并通過qRT-PCR檢測了f lhD C缺失對溶原菌和野生株幾個

13、運動相關(guān)基因表達量的影響。結(jié)果表明：ΦMin27溶原可增強大腸桿菌MG1655的fliA和 fliD基因的表達，提高菌株MG1655運動能力；flhDC基因缺失增強了fliA和fliD基因的表達，但未改變菌株運動特性；而MG1655△flhDC溶原菌則不具有運動能力，基因轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果顯示MG1655△flhDC溶原ΦMin27后，顯著抑制了fliA和fliD基因的表達，但并未影響 fliE基因的表達。fliA、fliD和 fliE單