Ⅱ型心腎綜合征患者中醫(yī)證候?qū)W特征與circRNA表達譜關系研究.pdf

1、目的:
　　研究分析Ⅱ型心腎綜合征患者相關臨床特征、主要中醫(yī)證候分布及不同中醫(yī)證候之間臨床特征的差異情況;檢測Ⅱ型心腎綜合征及不同中醫(yī)證候患者circRNA表達譜差異;檢測Ⅱ型心腎綜合征不同中醫(yī)證候患者的關鍵調(diào)節(jié)circRNA，并對其進行RT-PCR驗證，為Ⅱ型心腎綜合征患者中醫(yī)辨證分型提供客觀依據(jù)，為Ⅱ型心腎綜合征診斷提供生物學基礎。
　　方法:
　　1.1.Ⅱ型心腎綜合征患者臨床資料收集
　　選擇2009-2

2、016年在中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院心內(nèi)科住院的Ⅱ型心腎綜合征患者267例，運用Epidata3.1數(shù)據(jù)庫，建立Ⅱ型心腎綜合征患者的臨床資料數(shù)據(jù)庫，并收集健康人241人，分析比較Ⅱ型心腎綜合征患者與健康人之間的相關臨床特征。
　　1.2.不同GFR水平的Ⅱ型心腎綜合征患者臨床資料收集
　　選擇2009-2016年在中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院心內(nèi)科住院的Ⅱ型心腎綜合征患者267例，根據(jù)eGFR水平，分成三組（CKD3-5期），分析

3、比較Ⅱ型心腎綜合征患者不同分期的相關臨床特征。
　　1.3.Ⅱ型心腎綜合征患者中醫(yī)證候?qū)W分析
　　對267例Ⅱ型心腎綜合征患者的中醫(yī)癥狀進行歸納分析，將出現(xiàn)頻率＜10％癥狀剔除，篩選得到40個變量，運用聚類和因子分析等方法，得到Ⅱ型心腎綜合征不同中醫(yī)證候，并根據(jù)所得不同中醫(yī)證候進行相關臨床特征的比較分析。
　　1.4.Ⅱ型心腎綜合征患者外周血circRNA表達譜檢測和生物信息學分析
　　選取20例Ⅱ型心腎綜合征患

4、者和5例健康人，運用CapitalBio TechnologyHuman CircRNA Array v2芯片，篩選Ⅱ型心腎綜合征患者外周血中circRNA表達譜，利用miRanda軟件預測與其結(jié)合的miRNA，進而預測其轉(zhuǎn)錄本mRNA，運用生物信息學方法對Ⅱ型心腎綜合征患者差異表達mRNA進行功能分析。
　　1.5.Ⅱ型心腎綜合征不同中醫(yī)證候患者外周血circRNA表達譜檢測和生物信息學分析
　　選?、蛐托哪I綜合征不同中醫(yī)

5、證候患者20例，每個證候5例，同時選取健康人5例，運用CapitalBio Technology Human CircRNAArray v2芯片，篩選不同中醫(yī)證候以及不同中醫(yī)證候與健康人的差異表達circRNA，利用miRanda軟件預測與其結(jié)合的miRNA，進而預測其轉(zhuǎn)錄本mRNA，運用生物信息學方法對上述表達差異mRNA進行功能探索。
　　1.6.Ⅱ型心腎綜合征患者中醫(yī)證候?qū)WcircRNA驗證
　　分別對15例Ⅱ型心腎綜

6、合征患者和12例健康人、8例Ⅱ型心腎綜合征心腎不交、血瘀水停證和7例Ⅱ型心腎綜合征非心腎不交、血瘀水停證患者，應用RT-PCR技術對Ⅱ型心腎綜合征和Ⅱ型心腎綜合征心腎不交、血瘀水停證患者的特異circRNA進行驗證，分別得到Ⅱ型心腎綜合征和Ⅱ型心腎綜合征心腎不交、血瘀水停證的分子生物學基礎。
　　結(jié)果:
　　1.1.Ⅱ型心腎綜合征患者相關臨床特征結(jié)果
　　獨立樣本t檢驗結(jié)果顯示，CRS組紅細胞參數(shù)、白細胞參數(shù)、血小板參

7、數(shù)、血清酶學、肝腎功能、血脂、血漿蛋白及HCY方面均存在一定差異，Spearman相關性研究顯示，紅細胞參數(shù)、白細胞參數(shù)、血小板參數(shù)、血清酶學、肝腎功能、血脂、血漿蛋白與Ⅱ型心腎綜合征的發(fā)生具有一定的相關性。二分類Logistic逐步回歸分析，結(jié)果顯示，年齡、血清HCY水平是Ⅱ型心腎綜合征發(fā)病的重要因素。
　　1.2.不同GFR水平的Ⅱ型心腎綜合征患者相關臨床特征結(jié)果
　　采用單因素方差分析結(jié)果顯示，CKD3-5組患者在紅細

8、胞參數(shù)、血清酶學、血脂、腎功能、血漿蛋白、同型半胱氨酸、NT-proBNP、尿蛋白及心臟超聲方面均存在一定差異。
　　1.3.Ⅱ型心腎綜合征患者中醫(yī)證候?qū)W特征結(jié)果
　　通過聚類和因子分析，得到以下4個證候:脾腎陽虛、氣虛血瘀證;心腎陽虛、陽損及陰證;心腎不交、血瘀水停證;陰陽兩虛、血瘀痰濁證。
　　1.4.Ⅱ型心腎綜合征患者circRNA表達譜及生物信息學結(jié)果
　　Ⅱ型心腎綜合征患者與健康人比較，circRNA芯

9、片結(jié)果顯示，差異表達上調(diào)circRNA共1989個，下調(diào)circRNA共895個;差異表達的mRNA經(jīng)GO分析，細胞組分方面，表達差異的mRNA顯著富集于cell periphery、 plasma membrane、plasma membrane part、integral component of plasma membrane、intrinsic componentof plasma membrane等98條通路;分子功能方面，表

10、達差異的mRNA顯著富集于receptor activity、molecular transducer activity、signaling receptor activity、transmembrane signaling receptor activity、 signal transducer activity等143條通路;生物進程方面，表達差異的mRNA顯著富集于signaling、 response to chemical、s

11、ingle organism signaling、cell communication、cell surface receptor signalingpathway等595條通路。KEGG分析:Ⅱ型心腎綜合征患者與健康對照組差異表達mRNA富集于Hematopoietic cell lineage、Cell adhesion molecules(CAMs)等2條通路。
　　1.5.Ⅱ型心腎綜合征患者中醫(yī)證候?qū)WcircRNA表達譜及

12、生物信息學分析
　　脾腎陽虛、氣虛血瘀證與健康人比較，差異表達上調(diào)circRNA共2614個，下調(diào)circRNA共516個;心腎陽虛、陽損及陰證與健康人比較，差異表達上調(diào)circRNA共847個，下調(diào)circRNA共1947個;心腎不交、血瘀水停證與健康人比較，差異表達上調(diào)circRNA共3272個，下調(diào)circRNA共2381個;陰陽兩虛、血瘀痰濁證與健康人比較差異表達上調(diào)circRNA共3262個，下調(diào)circRNA共1590

13、個;脾腎陽虛、氣虛血瘀證與心腎陽虛、陽損及陰證比較，差異表達上調(diào)circRNA共1760個，下調(diào)circRNA共80個;脾腎陽虛、氣虛血瘀證與心腎不交、血瘀水停證比較，差異表達上調(diào)circRNA共329個，下調(diào)circRNA共103個;心腎不交、血瘀水停證與心腎陽虛、陽損及陰證比較，差異表達上調(diào)circRNA共620個，下調(diào)circRNA共139個;陰陽兩虛、血瘀痰濁證與脾腎陽虛、氣虛血瘀證比較，差異表達上調(diào)circRNA共120個，下

14、調(diào)circRNA共75個;陰陽兩虛、血瘀痰濁證與心腎陽虛、陽損及陰證比較，差異表達上調(diào)circRNA共1887個，下調(diào)circRNA共224個;陰陽兩虛、血瘀痰濁證與心腎不交、血瘀水停證比較，差異表達上調(diào)circRNA共202個，下調(diào)circRNA共27個。
　　各不同中醫(yī)證候與健康組比較，差異表達mRNA富集于多條生物通路，如locomotion、single organism signaling、 signaling、 cel

15、l communication、anatomicalstructure morphogenesis等通路;各中醫(yī)證候之間比較，差異表達mRNA富集于多條生物通路，如DNA repair、embryo development ending in birth or egg hatching、chordate embryonic development、cellular component organization、single-organi

16、smcellular process等通路。
　　1.6.Ⅱ型心腎綜合征患者不同中醫(yī)證候外周血circRNA實時定量PCR結(jié)果
　　CRS組與Health組比較，hsa_ cir_0001763的△CT明顯低于對照組，hsa_ circ_0079598的△CT明顯高于對照組，差異具有極顯著性統(tǒng)計學意義(P＜0.01);心腎不交、血瘀水停證組（XS組）與非心腎不交、血瘀水停證組(FXS組)比較，hsa_circ_0025640

17、的△CT明顯低于對照組，差異具有顯著性統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，上述結(jié)果均與circRNA芯片結(jié)果一致。ROC曲線結(jié)果顯示，hsa_cir_0001763曲線下面積(AUC)為0.933，敏感性為86.67％，特異性為83.33％，預測Ⅱ型心腎綜合征的正確率為85.18％，hsa_ circ_0079598曲線下面積(AUC)為0.911，敏感性為73.33％，特異性為91.67％，預測Ⅱ型心腎綜合征的正確率為81.48％，hsa_

18、circ_0025640曲線下面積(AUC)為0.875，敏感性為87.50％，特異性為71.43％，預測Ⅱ型心腎綜合征心腎不交、血瘀水停證的正確率為80.00％，提示hsa_cir_0001763水平越高，hsa_circ_0025640水平越低，則患Ⅱ型心腎綜合征的可能性越大，hsa_circ_0025640水平越高，則患Ⅱ型心腎綜合征心腎不交、血瘀水停證的可能性越大。
　　結(jié)論:
　　1.Ⅱ型心腎綜合征患者隨著腎功能損

19、傷的不斷加重，其造血系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等系統(tǒng)功能障礙加重，病情惡化。
　　2.Ⅱ型心腎綜合征患者臨床表現(xiàn)為本虛標實，虛實夾雜。其常見證候為脾腎陽虛、氣虛血瘀證，心腎不交、血瘀水停證，心腎陽虛、陽損及陰證及陰陽兩虛、血瘀痰阻證。
　　3.Ⅱ型心腎綜合征患者發(fā)病機制可能與Hematopoietic cell lineage通路、Toll樣受體信號通路、MAPK信號通路、Wnt信號通路等信號通路有關。

20、r>　　4.Ⅱ型心腎綜合征患者脾腎陽虛、氣虛血瘀證關鍵上調(diào)circRNA為hsa-circRNA14362-14、 hsa_ circ_0127021、 hsa_ circ_0117337、hsa_ circ_0060535、hsa_ circ_0138971，關鍵下調(diào)circRNA為hsa-circRNA9066-1、hsa_ circ_0136708;心腎陽虛、陽損及陰證關鍵下調(diào)circRNA為hsa_circ_0103678、hs

21、a-circRNA6809-9、hsa-circRNA11277-1、hsa_ circ_0122389;心腎不交、血瘀水停證關鍵上調(diào)circRNA為hsa_ circ_0012956、hsa_ circ_0100172、hsa_ circ_0025640、hsa_ circ_0025641、hsa_circ_0117312、has_ circ_0133589，關鍵下調(diào)circRNA為has_circ_0103164、hsa_ circ