Apoptin在檢測人外周血CTCs中的應用價值探討.pdf

1、研究背景：
　　循環(huán)腫瘤細胞（Circulating tumor cells,CTCs）是指由腫瘤原發(fā)灶釋放進入外周循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤細胞，在癌癥轉移中具有關鍵作用。研究表明，相對于外周血未檢測到CTCs的患者來說，檢測到CTCs的患者預后較差；相對于治療后CTCs數(shù)升高的患者來說，治療后CTCs數(shù)降低的患者預后明顯改善。因此，CTCs檢測在腫瘤患者的鑒別診斷、生存期預測、治療效果監(jiān)測等方面有一定的應用價值。然而，由于CTCs數(shù)量稀

2、少，其檢測存在著重重困難。目前，基于CTCs的性質（如位于細胞表面的EpCAM）開發(fā)了一系列分離、檢測技術，但都存在敏感性或者特異性不高等缺陷。因此探索能夠從外周血細胞中準確、靈敏地檢測出CTCs的技術是十分有必要的。
　　凋亡素（Apoptin）是一種源自于雞貧血病毒（CAV）的能夠特異性促進腫瘤細胞凋亡的小分子蛋白。研究發(fā)現(xiàn)Apoptin在腫瘤細胞和正常細胞中的定位不同，它在腫瘤細胞主要定位在細胞核，而在正常細胞中主要定位在細

3、胞質。Apoptin的這一特性為鑒別腫瘤細胞和正常細胞提供了理論基礎，提示利用Apoptin的定位特點可以從外周血細胞中鑒定出CTCs。
　　熒光素是一種能夠產(chǎn)生熒光的有機合成染料，在激發(fā)光照射下可以釋放出熒光，它能與蛋白質分子穩(wěn)定結合，標記后不影響蛋白質的活性，熒光效率高且與蛋白結合的需要量小，性質穩(wěn)定且易于保存，在科研實驗中可用于同蛋白質結合以實現(xiàn)蛋白質的可視性。
　　綠色熒光蛋白（GFP）是一種27kDa大小的蛋白質，

4、該蛋白在激發(fā)光照射下，會發(fā)出綠色熒光。在生物學研究中常用GFP來作為生物標記。將這種熒光分子通過分子生物學手段結合在待標記的物質上，就可以在熒光顯微鏡下觀察到被標記的物質。
　　目的：
　　利用Apoptin在腫瘤細胞中的定位特點和熒光物質/綠色熒光蛋白的可視性，將蛋白質形式的Apoptin用熒光物質標記后作用于細胞，或者將Apoptin DNA序列與綠色熒光蛋白DNA序列融合后直接在細胞內(nèi)表達，根據(jù)Apoptin在正常細胞

5、和腫瘤細胞中的定位差異，來鑒別正常細胞和腫瘤細胞。
　　方法：
　　1.構建原核表達質粒pET-28b（+）-TAT-Apoptin并表達重組蛋白。
　　2.構建真核表達質粒pEGFP-N1-Apoptin、pcDNA3.1(+)-Apoptin。
　　3.采用重疊延伸技術擴增Apoptin-1T基因（Thr-108突變?yōu)镚ly）和Apoptin-3T基因（Thr-106、107、108突變?yōu)镚ly、Pro、Gl

6、y），構建真核質粒pEGFP-N1-Apoptin-1T、pEGFP-N1-Apoptin-3T。
　　4.利用lipo2000將真核表達質粒轉染腫瘤細胞Saos-2、H460，在48h后用CCK8檢測細胞活性，篩選出促腫瘤細胞凋亡作用最小的真核表達質粒。
　　5.利用電轉法將真核表達質粒轉染正常細胞和腫瘤細胞，在轉染后24h、48h、72h用Hoechst33342進行核染色，用熒光顯微鏡觀察綠色熒光在細胞內(nèi)分布情況，統(tǒng)計

7、綠色、藍色熒光同時聚集在細胞核的細胞數(shù)/同時有綠色、藍色熒光的細胞數(shù)的百分比，該百分比分別代表Apoptin識別正常細胞的特異性和腫瘤細胞的敏感性，比較不同時間點時的敏感性，篩選出Apoptin識別腫瘤細胞能力最佳時的條件。
　　6.收集臨床腫瘤病人、體檢正常人的外周血標本，用pEGFP-N1-Apoptin-3T轉染PBMC，48h后用Hoechst33342進行核染色，用熒光顯微鏡觀察綠色、藍色熒光在細胞內(nèi)的分布，并根據(jù)綠色、

8、藍色熒光的重疊情況，判斷PBMC中的CTCs。
　　結果：
　　1.成功構建了pET-28b（+）-TAT-Apoptin原核表達質粒，并表達出15kDa大小的蛋白，利用Ni-NTA親和層析柱純化了Apoptin蛋白，但蛋白穩(wěn)定性差，易沉淀，不適合用熒光素標記。
　　2.成功構建了真核表達質粒pEGFP-N1-Apoptin、pcDNA3.1(+)-Apoptin、pEGFP-N1-Apoptin-1T、pEGFP-N

9、1-Apoptin-3T。
　　3.相比野生型Apoptin-EGFP，Apoptin-EGFP-3T對腫瘤細胞促凋亡作用下降，提示相較于野生型Apoptin-EGFP，Apoptin-EGFP-3T對CTCs的促凋亡作用下降。
　　4.Apoptin-EGFP在正常細胞MSC中全部存在于細胞質，在腫瘤細胞Saos-2、H460中絕大部分聚集在細胞核，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)野生型Apoptin-EGFP、Apoptin-EGFP-1T、A

10、poptin-EGFP-3T在48h時識別腫瘤細胞的敏感性最高，且三種Apoptin-EGFP識別腫瘤細胞的敏感性無統(tǒng)計學差異。
　　5.Apoptin-EGFP-3T在肺癌病人和正常人中識別CTCs的比率存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05），肺癌病人的CTCs比率明顯高于正常人。
　　結論：
　　1.基于pET-28b（+）質粒的原核表達系統(tǒng)能夠表達TAT-Apoptin，但由于Apoptin蛋白穩(wěn)定性差，在緩沖液中易形成

11、沉淀，因此采用蛋白質標記形式不適合后續(xù)CTCs檢測試驗。
　　2.在鑒別正常細胞MSC時，Apoptin-EGFP的特異性可達到100％。在鑒別腫瘤細胞Saos-2、H460時，Apoptin-EGFP的敏感性可分別達到49.53%±3.55%和40.82%±4.26%，最佳的檢測時間點是轉染后48h。
　　3.本研究利用Apoptin-EGFP-3T轉染并直接觀察的方法在肺癌病人中檢測出的CTCs比率明顯高于正常人（P＜0