藤黃酸抑制胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞c-KIT酪氨酸激酶表達(dá)及活性的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　探討藤黃酸抑制人胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞（GIST-T1）增殖、克隆，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，及其對c-KIT酪氨酸激酶表達(dá)和活性的影響的研究。
　　方法:
　　體外培養(yǎng)人胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞親本株（GIST-T1）。采用一定濃度梯度的藤黃酸作用于上述細(xì)胞。CCK8法檢測藥物對細(xì)胞株增殖能力的影響；流式細(xì)胞技術(shù)檢測藥物對細(xì)胞株凋亡的影響；平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測藥物對細(xì)胞株克隆形成能力的影響；Western Blot技術(shù)檢測藥物處理后細(xì)胞

2、中c-KIT、p-c-KIT、HSP90和CDC37蛋白的表達(dá)水平；ELISA法檢測藥物對細(xì)胞株分泌SCF蛋白的影響。Real-Time PCR檢測經(jīng)藥物處理后細(xì)胞株中c-KIT、KITLG、HSP90和CDC37 mRNA的表達(dá)水平；
　　結(jié)果:
　　1、具有一定濃度梯度的藤黃酸體外對人胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞株（GIST-T1）有顯著的增殖抑制作用，且其抑制率與藥物濃度及作用時間呈正相關(guān)。當(dāng)藤黃酸濃度為32μmol/L、處理時間為

3、48h及72h時，其抑制率分別可達(dá)到91.54％、93.26%；經(jīng)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)和軟件分析顯示：藤黃酸處理 GIST-TI細(xì)胞24h、48h、72h后的IC50值分別約為6.318μmol/L、4.035μmol/L、3.026μmol/L。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示：與對照組（0μmol/L）相比，低濃度藥物組（0.5μmol/L）不同處理時間的抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高藥物濃度組（1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0

4、μmol/L）的抑制率與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2、流式細(xì)胞技術(shù)提示一定濃度梯度藤黃酸體外對人胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞株（GIST-T1）凋亡具有明顯的誘導(dǎo)作用，且其作用與藥物濃度呈正相關(guān)，濃度越高，細(xì)胞總體凋亡率越高。
　　3、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)提示一定濃度梯度藤黃酸體外作用于人胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞株（GIST-T1）后，細(xì)胞的克隆形成能力受到明顯的抑制，且其克隆形成率隨著藥物濃度升高而逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

5、P<0.05）。
　　4、一定濃度梯度藤黃酸（0、1、2、4、8μmol/L）體外作用于人胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞株（GIST-T1）后，經(jīng)Western Blot法檢測顯示，c-KIT、p-c-KIT、CDC37蛋白表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)化水平呈濃度依賴性降低，各實(shí)驗(yàn)組與對照組（0μmol/L）相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；HSP90蛋白表達(dá)量的降低在較高藥物濃度組中表現(xiàn)較顯著，但低藥物濃度組（1μmol/L）與對照組相比，蛋白表達(dá)量標(biāo)

6、準(zhǔn)化水平未見降低，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其余各藥物組與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。
　　5.酶聯(lián)免疫吸附測定實(shí)驗(yàn)(ELISA)提示一定濃度梯度藤黃酸體外對人胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞株（GIST-T1）分泌SCF蛋白的能力具有明顯的抑制作用，且抑制作用與藥物濃度呈正相關(guān)，各實(shí)驗(yàn)組與對照組（0μmol/L）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　6.Real-Time PCR法提示一定濃度梯度藤黃酸（0、1、2、4、

7、8μmol/L）體外對人胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞株（GIST-T1）轉(zhuǎn)錄c-KIT、KITLG、HSP90、CDC37 mRNA的能力均有明顯的抑制作用，mRNA表達(dá)量隨著藥物濃度升高而逐漸降低，各實(shí)驗(yàn)組與對照組（0μmol/L）相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　藤黃酸能明顯抑制人胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞株（GIST-T1）的增殖和克隆并誘導(dǎo)其凋亡，其抑制腫瘤生長發(fā)展的機(jī)制可能與降低 c-KIT酪氨酸激酶表達(dá)和磷酸化活