凍干血小板在深Ⅱ度燙傷大鼠模型中對創(chuàng)面愈合作用研究.pdf

1、背景：
　　血小板是哺乳動物血液中的有形成分之一，是從骨髓成熟的巨核細(xì)胞胞質(zhì)裂解脫落下來的具有生物活性的小塊胞質(zhì)，體積小，無細(xì)胞核。血小板主要發(fā)揮凝血、止血以及修補(bǔ)破損血管的功能，臨床上血小板用于血小板數(shù)量減少或血小板功能障礙患者的救治。國際上通用的保存方式是在22±2℃條件下振蕩保存，保存時間最多不超過7天，我國的血站技術(shù)操作規(guī)程(2012版)規(guī)定血小板保存為22±2℃條件下振蕩保存5天。由于保存時間短，臨床需求量大，目前對血小

2、板的持續(xù)供應(yīng)難以得到保證，戰(zhàn)爭、自然災(zāi)害和突發(fā)事件時的保障更加艱難。劉景漢等國內(nèi)學(xué)者們在血小板中加入了冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜(DMSO)來延長血小板濃縮液的保存時間，目前大約可延長至1年。但DMSO具有一定毒性，F(xiàn)DA許可的DMSO濃度為0.2％，我們國內(nèi)目前使用DMSO濃度為5％，遠(yuǎn)期毒性仍無法估測，國家標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程上沒有明確對其進(jìn)行描述。并且-80℃深低溫冰凍保存在戰(zhàn)爭或突發(fā)事件時也很難實現(xiàn)。在20世紀(jì)50年代，美軍通過在添加各種保護(hù)

3、劑進(jìn)行預(yù)處理，來提高血小板的抗凍和抗干燥能力以實現(xiàn)對濃縮血小板的凍干保存，提出了凍干血小板(freeze dried platelets，F(xiàn)DP)的概念。FDP有常溫保存、體積小、質(zhì)量輕、便于長途運輸?shù)葍?yōu)點。
　　創(chuàng)面是指正常皮膚組織在外界致傷因子如外科手術(shù)、外力、熱、電流、化學(xué)物質(zhì)、低溫以及機(jī)體內(nèi)在因素如局部血液供應(yīng)障礙等作用下所導(dǎo)致的損害。創(chuàng)面的愈合是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，其過程包括了炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、結(jié)締組織形成、創(chuàng)面收縮

4、和創(chuàng)面重塑等幾個階段。在整個過程中多種修復(fù)細(xì)胞、炎癥介質(zhì)、生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)的成份共同參與，并在機(jī)體的調(diào)控下呈現(xiàn)高度的有序性、完整性和網(wǎng)絡(luò)性[1]。其中任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生紊亂將直接影響創(chuàng)面愈合的進(jìn)程。
　　20世紀(jì)90年代開始，研究者發(fā)現(xiàn)血小板能釋放多種生物活性物質(zhì)，其中包括多種生長因子，繼而開始研究血小板對創(chuàng)面愈合的作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)血小板能釋放300多種生物活性物質(zhì)。這些生長因子可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化，增加膠原的合成能力，對

5、促進(jìn)基質(zhì)合成、沉降及組織的形成都有著重要的作用，而且各種生長因子之間有良好的協(xié)同作用[3]，可明顯促進(jìn)創(chuàng)面愈合[2]。由于最初研究的外科醫(yī)生將其稱為富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)，相關(guān)研究對其說法沿用至今。PRP已經(jīng)廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷修復(fù)方面的研究，涉及如口腔頜面外科、眼科、整形、骨科、燒傷等多學(xué)科，甚至在基因工程、細(xì)胞培養(yǎng)組織工程、抗衰老方面也顯現(xiàn)出了獨特的作用，治療效果獲得國內(nèi)外學(xué)者的證實和充分肯定，P

6、RP不但可以提高止血效果、縮短手術(shù)時間，還可以減輕手術(shù)后腫脹、促進(jìn)傷口愈合，對創(chuàng)傷修復(fù)和組織重建具有重要的價值。
　　研究證明FDP在復(fù)水化后，恢復(fù)率可達(dá)60-70％[4]，保留了許多新鮮血小板形態(tài)學(xué)和功能上的特性。凍干血小板是否能像新鮮血小板一樣用于對血液病患者的救治作用仍未知。研究發(fā)現(xiàn)復(fù)水化后的FDP在被激活后和PRP相似，均可釋放出多種生長因子。那么FDP是否能首先應(yīng)用于創(chuàng)面愈合，我們因此提出我們的研究方案。
　　臨床

7、上常見的急性創(chuàng)面除手術(shù)切口、皮膚擦傷外，燙傷也是常見病多發(fā)病。臨床上采用抗生素和手術(shù)治療，雖有一定的療治療效果，但患者常常出現(xiàn)創(chuàng)面收斂慢、產(chǎn)生耐藥菌、肝腎功能損傷以及機(jī)體免疫功能降低等反應(yīng);因此本課題希望通過建立SD大鼠深Ⅱ度燙傷模型，來探究FDP在燙傷創(chuàng)面愈合中的修復(fù)作用。
　　目的：
　　將血小板濃縮液進(jìn)行凍干處理后制備成FDP，并將其應(yīng)用于大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的愈合，觀察FDP使用后創(chuàng)面的愈合情況，以驗證FDP外用治療燙

8、傷的療效，為其進(jìn)一步應(yīng)用于臨床提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、FDP的制備
　　(1)PRP的制備
　　采用無償獻(xiàn)血者捐獻(xiàn)的全血，按國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗合格后進(jìn)行血小板分離，1500×g離心10min分離出上層富含血小板血漿，再將此富含血小板血漿經(jīng)3000×g離心20min，分離出上層貧血小板血漿和下層富血小板血漿，用貧血小板血漿來調(diào)整后者血小板的濃度，直至計數(shù)為1000×109/L備用。
　　(2)PRP的凍

9、干處理
　　預(yù)處理液的配制:采用NaCl、KCl、CaCl2 MgSO4、 NaHCO3、檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸鈉、葡萄糖、超純水、海藻糖及可逆性血小板激活抑制劑，調(diào)PH為6.6～6.8，0.22μm濾器過濾;凍干緩沖液的配制:血小板預(yù)處理液中加入總體積30％的同型血漿，調(diào)PH為6.6～6.8，0.22μm濾器過濾后備用。血小板1500×g離心15min，棄去上清，保留下層血小板沉淀物，用與棄去上清相同體積的預(yù)處理液重懸血小板，3

10、7℃水浴振蕩4h，使血小板保持懸浮狀態(tài)。4h水浴后，將血小板懸液再以1500×g離心15min，棄去上清，保留下層血小板沉淀物，用與棄去上清相同體積的凍干緩沖液重懸血小板。將預(yù)處理后血小板懸液轉(zhuǎn)移到硅化玻璃瓶中，每瓶4ml，置于-80℃超低溫冰箱中冷凍過夜，次日將凍于機(jī)打開并使溫度降至-45℃后，再將樣品從-80℃超低溫冰箱取出，轉(zhuǎn)入凍干機(jī)進(jìn)行真空干燥，冷阱溫度為-45±5℃，真空度＜133mbar，24h后取出，并將其密封后保存于室溫

11、。
　　(3)凍干血小板復(fù)水化檢測
　　室溫下保存1d以上的樣品將其復(fù)水化，復(fù)水化液為貧血小板血漿(platelet-poor plasma，PPP):無菌水=3∶1(v/v)，加入4ml復(fù)水化液后的樣品，輕輕振蕩至完全溶解，用血細(xì)胞計數(shù)儀分別測定凍干前及復(fù)水化后血小板計數(shù)和平均血小板體積(mean platelet volume，MPV)，并計算血小板回收率與MPV凍干前后差值;檢測血小板凍干前及凍干后d0、d10、d30

12、生長因子VEGF、TGF-β、PDGF-BB的釋放含量。
　　2、SD大鼠深Ⅱ度燙傷模型的建立及FDP用于創(chuàng)面治療的效果研究
　　將40只大鼠背部脫毛，脫毛面積4cm×6cm左右，用清水洗凈，觀察24h，確定脫毛部位皮膚無紅腫、炎癥和破損等異常情況。次日，SD大鼠禁食8h以上，用10％水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，劑量為300mg/kg，麻醉生效后將大鼠固定于操作臺，75％酒精消毒備皮區(qū)域。將不銹鋼鍋盛水置于電磁爐上，并將50g

13、的砝碼置于鍋內(nèi)加熱至沸騰，持續(xù)5min。用止血鉗夾住砝碼上端立即置于大鼠脊柱兩側(cè)備皮區(qū)，稍加壓力，維持15s，即可形成半徑為1cm的圓形深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面;根據(jù)臨床燒傷處理常規(guī)，3h后行削痂術(shù)，直至創(chuàng)面由蒼白變?yōu)榧t潤為止。將造模成功的40只大鼠隨機(jī)分成四組，再根據(jù)組別進(jìn)行上藥。FDP組:將每瓶凍干血小板用4mL同型血漿復(fù)溶，與葡萄糖酸鈣以10∶1的比例混合進(jìn)行激活后，噴灑于無菌紗布上，制備成血小板凝膠紗布(1mL/創(chuàng)面)，無菌紗布包扎;PR

14、P組:調(diào)整血小板濃度為1000×109/L，其他操作步驟同F(xiàn)DP組;燙傷膏組:無菌棉簽直接涂抹后，無菌紗布包扎;空白組:僅用無菌紗布浸濕生理鹽水包扎。換藥時間分別為d1、d3、d5、d7、d9、d13、d19，換藥同時用透明坐標(biāo)紙覆蓋創(chuàng)面，沿創(chuàng)緣畫膜，計算創(chuàng)面面積，并每組隨機(jī)選取一個創(chuàng)面，取直徑約為1cm的創(chuàng)面組織用于組織學(xué)檢查(HE染色)。
　　結(jié)果：
　　在血小板凍干效果評價中，凍干前后血小板數(shù)量和MPV存在著統(tǒng)計學(xué)的差

15、異，細(xì)胞回收率為87.24％;生長因子VEGF、TGF-β和PDGF-BB釋放量隨著保存時間的延長并未有統(tǒng)計學(xué)上的差異，但PDGF-BB的含量在凍干前后有所差異(P＜0.05)。
　　在動物實驗中，不同處理組對大鼠燙傷創(chuàng)面愈合率的影響結(jié)果表明，在治療過程中，燙傷創(chuàng)面結(jié)痂面積逐步減小，愈合率顯著上升。在治療的d7，PRP組與FDP組均使大鼠燙傷創(chuàng)面面積明顯縮小，具有明顯的促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用，與實驗對照組差異有顯著性(P＜0.05)，而

16、PRP組FDP組之間無明顯差異。提示FDP具有與PRP相近的促進(jìn)燙傷創(chuàng)面早期愈合的作用。
　　不同處理組對大鼠燙傷創(chuàng)面病理組織學(xué)的影響。100倍鏡下觀察d1的組織標(biāo)本:皮膚損傷至真皮深層，細(xì)胞水腫，變性壞死，正常結(jié)構(gòu)消失，呈空洞狀，膠原纖維斷裂，已符合深Ⅱ度燙傷的判定標(biāo)準(zhǔn)，提示造模成功;用藥d7: FDP組和PRP組表皮及真皮組織均有明顯的改善，皮膚創(chuàng)面的壞死組織及炎性滲出物顯著減少，毛細(xì)血管周圍有許多新生的成纖維細(xì)胞，可見大量肉

17、芽組織形成，而燙傷膏組和空白組仍表現(xiàn)為表皮急性化膿性炎癥，細(xì)胞變性壞死，僅有少量肉芽組織形成;用藥d19: FDP組和PRP組表皮恢復(fù)，可見少量毛囊和皮脂腺，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)良好，真皮組織中的膠原纖維排列清晰，無溶解或雜亂現(xiàn)象，燙傷膏組和空白組仍有部分凝固性壞死和少量肉芽組織，未見毛囊和皮脂腺。
　　結(jié)論：
　　血小板經(jīng)過凍干后，從血小板的外觀、回收率、MPV和凍干前后生長因子含量及穩(wěn)定性等方面分析，本凍干方案基本可行，已滿足凍