免疫蛋白酶體亞基LMP10在血管緊張素Ⅱ引起的視網膜病變中的作用及機制.pdf

1、高血壓視網膜病變主要通過影響視網膜血管病理變化引起視網膜病理生理改變，其主要臨床特征包括視網膜動脈變細反光增強、動靜脈比例減小、動靜脈交叉壓迫征、出血、棉絮斑、嚴重者出現(xiàn)視神經視盤水腫及動脈硬化的各種并發(fā)癥。
　　泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是真核細胞內重要的蛋白質降解系統(tǒng)之一，參與調節(jié)細胞周期、基因轉錄、抗原呈遞、細胞增殖與分化以及信號轉導等多種生理過程。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)由泛素、泛素活化酶、泛素連接酶、泛素蛋白連接酶、26S蛋白酶體和去

2、泛素化酶組成。泛素-蛋白酶體降解蛋白是一種級聯(lián)反應過程。完成泛素化的蛋白質最終被20S蛋白酶體所降解。免疫蛋白酶體是一種由標準蛋白酶體衍生的高效的蛋白水解機制，在各類炎癥性疾病的發(fā)病機制中起著至關重要的作用。20S免疫蛋白酶體包含三個β功能亞單位（也被稱為免疫蛋白酶體亞基），包括β1i（LMP2和PSMB9）表達半胱氨酸蛋白酶活性，β2i（LMP10，PSMB10或mecl-1）表達胰蛋白酶活性和β5i（LMP7或PSMB8）表達糜蛋白

3、酶活性，研究證明免疫蛋白酶體具有更廣泛的生物學功能。在血管緊張素Ⅱ或高鹽刺激引起的系統(tǒng)性高血壓病變模型中，LMP10和LMP7兩種免疫蛋白亞基在心臟組織中表達增加，高鹽誘導高血壓模型LMP10敲除對小鼠心臟重構具有抑制作用。此外，視網膜病變組織中免疫蛋白酶體亞基的表達和活性也明顯增加。抑制免疫蛋白酶體的活性能夠改善疾病的發(fā)生。然而，LMP10在視網膜病變中的作用機制研究甚少，在血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓視網膜病變模型中的作用尚不清楚。

4、r>　　本研究通過建立血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓視網膜病變模型，采用野生型、LMP10基因敲除以及LMP10基因過表達三種不同小鼠，觀察在基因敲除/過表達或應用IKKβ抑制劑的作用下不同模型的視網膜病理生理變化，旨在闡述LMP10在高血壓視網膜病變中的作用機制，進一步探索LMP10通過降解PTEN和IKBα降低炎癥相關通路反應從而改善視網膜病變的病理生理過程。
　　目的:
　　1.建立血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓視網膜病變野生小鼠

5、模型，觀察小鼠視網膜及外周血清中蛋白酶體亞基LMP10及胰蛋白酶活性水平，在臨床高血壓視網膜病變患者外周血清中檢測LMP10水平，明確LMP10在高血壓視網膜病變患者及鼠模型中的表達變化。
　　2.應用LMP10基因敲除鼠建立血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓視網膜病變模型，觀察野生/基因敲除鼠視網膜病理表型變化，探討LMP10對高血壓小鼠視網膜形態(tài)學、炎癥、血管通透性改變、氧化應激的影響，從分子水平闡述LMP10在高血壓視網膜病變中的作用

6、機制。
　　3.應用腺相關病毒構建眼內LMP10過表達小鼠，觀察該鼠模型在血管緊張素Ⅱ誘導下視網膜形態(tài)學、血管通透性改變、炎癥及氧化應激的病理改變，進一步探討LMP10在高血壓視網膜病變中的分子機制
　　4.應用IKKβ特異性抑制劑IMD-0354作用于LMP10過表達/GFP空白對照小鼠，觀察阻斷NF-κB相關炎癥通路后不同組小鼠的視網膜病變情況，闡述LMP10及IMD-0354對PTEN/AKT/IKK通路的作用機制，討

7、論降低LMP10或應用IKK抑制劑能夠改善由血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓視網膜病變的分子機制。
　　方法:
　　1.高血壓視網膜病變小鼠模型建立:應用血管緊張素Ⅱ(3000ng/kg/min)緩釋泵灌注C57BL/6野生型小鼠，LMP10基因敲除小鼠3周誘導視網膜病變。給小鼠眼玻璃體腔注射2型腺相關病毒rAAV2-GFP對照或rAAV2-LMP10過表達LMP10，腹腔內注射IKK抑制劑IMD-0354預處理小鼠。
　　2

8、.臨床資料和血清收集。包括健康人、高血壓患者（不合并高血壓視網膜病變）和高血壓視網膜病變患者一般情況、病例資料、眼科檢查及眼底照相、血清標本。使用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清標本LMP10含量，蛋白酶體活性試劑盒檢測胰蛋白酶活性。
　　3.視網膜病理觀察:應用眼底血管造影系統(tǒng)觀察小鼠視網膜血管整體情況;應用石蠟切片HE染色法、免疫組織化學方法、冰凍切片免疫熒光技術觀察視網膜形態(tài)學、血管通透性、血管內皮細胞增殖、炎癥及氧化應激反應。

9、>　　4.應用蛋白質免疫印跡法（Western-blot）檢測LMP10，PTEN，p-AKT，AKT,p-IKKα/β，IKKβ，p-IkBα，IkBα，p-p65和p65蛋白水平。
　　結果:
　　1.在血管緊張素Ⅱ（3000ng/kg/min，3周）誘導下，小鼠收縮壓顯著性升高。免疫蛋白酶體亞基LMP10及其胰蛋白酶活性在血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓視網膜病變模型鼠的視網膜和血清，以及高血壓視網膜病變患者的血清中表達增加。

10、
　　2.LMP10缺乏能夠改善由血管緊張素Ⅱ誘導視網膜形態(tài)學改變、血管通透性增加、炎癥反應加重及氧化應激的損傷。(1)HE染色顯示血管緊張素Ⅱ誘導的野生型小鼠視網膜較鹽水組厚度增加，LMP10基因敲除小鼠視網膜厚度較野生型小鼠減少，差異具有統(tǒng)計性意義。(2)視網膜血管造影顯示血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓野生型小鼠視網膜動脈血管變細，小動脈狹窄，可見熒光彌散及滲漏，提示視網膜血管損傷，通透性增加。在LMP10敲除的高血壓小鼠模型中，這

11、一病理改變減輕。凝集素B4(Isolectin B4)免疫熒光染色顯示血管緊張素Ⅱ誘導的野生型小鼠視網膜血管內皮細胞增殖，LMP10敲除減輕了內皮細胞的增殖現(xiàn)象。此外，血管內皮細胞生長因子VEGF的蛋白水平變化也與視網膜血管通透性增加相關，且水平變化趨勢具有一致性。(3)二氫乙錠（超氧化物陰離子熒光探針，DHE）染色顯示血管緊張素Ⅱ誘導的小鼠視網膜ROS活性氧增加，提示氧化應激反應的激活，在LMP10敲除小鼠視網膜氧化應激程度減輕。同時

12、視網膜氧化應激NOX1和NOX4亞基mRNA水平的檢測支持這一現(xiàn)象。(4)Iba1（小膠質細胞/巨噬細胞特異性蛋白抗體）免疫組織化學染色顯示在血管緊張素Ⅱ誘導的野生型小鼠視網膜中，激活的小膠質細胞及巨噬細胞增加，炎癥相關因子IL-1和IL-6mRNA水平表達上調，LMP10敲除后，視網膜炎癥表達減少。
　　3.通過檢測PTEN/AKT/NF-κB信號通路蛋白，發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ引起野生型小鼠視網膜p-IKKα/βand p-p65蛋

13、白水平表達增加，LMP10敲除小鼠能夠部分逆轉這一現(xiàn)象。此外，血管緊張素Ⅱ引起的IkBa蛋白降低在LMP10敲除的小鼠中得到顯著逆轉。說明LMP10敲除減少了IKKα/β和IkBa的降解，進一步抑制了NF-kB通路的激活。同時，我們還發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ引起PTEN蛋白水平降低，AKT水平增高，而這一變化在LMP10敲除小鼠視網膜中得到逆轉。
　　4.眼內LMP10過表達小鼠模型的建立。玻璃體腔注射2型腺相關病毒(rAAV2)LMP1

14、0/GFP兩周后冰凍切片顯示視網膜腺相關病毒轉染良好，與rAAV2-GFP小鼠相比，rAAV2-LMP10小鼠視網膜LMP10蛋白含量升高1.8倍。
　　5.過表達LMP10能夠加重血管緊張素Ⅱ誘導的視網膜形態(tài)學改變、血管通透性增加、炎癥反應激活及氧化應激的損傷。在3周血管緊張素Ⅱ的誘導下，rAAV2-GFP小鼠中央視網膜厚度增加，視網膜血管通透性增加、管腔變窄、血管內皮細胞增殖，VEGF蛋白及mRNA水平增高，這些病理改變在rA

15、AV2-LMP10小鼠視網膜中表現(xiàn)更加明顯。同時血管緊張素Ⅱ誘導視網膜氧化應激及炎癥損傷，NOX1、NOX4、IL-1、IL-6mRNA表達增加，這些改變在rAAV2-LMP10小鼠視網膜中更加突出。
　　6.血管緊張素Ⅱ誘導的rAAV2-GFP小鼠視網膜PTEN和IkBa蛋白表達減少，LMP10過表達使這兩種蛋白表達進一步減少。同時LMP10的過表達使血管緊張素Ⅱ誘導增多的AKT，IKKα/β和p65磷酸化水平進一步增加。

16、>　　7.腹腔注射IKKβ抑制劑IMD-0354能夠有效緩解由血管緊張素Ⅱ引起的中央視網膜厚度的增加，視網膜血管通透性的增加及VEGF mRNA及蛋白表達水平的提高。同時，IMD-0354的應用能夠降低由血管緊張素Ⅱ引起的氧化應激反應，抑制視網膜小膠質/巨噬細胞的激活及減少NOX1、NOX4、IL-1、IL-6mRNA表達量。
　　8.蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)應用IMD-0354不能影響PTEN水平及AKT磷酸化程度。在血管緊張素Ⅱ誘導下

17、的rAAV2-LMP10或rAAV2-GFP小鼠視網膜組織中，IMD-0354能夠顯著抑制IKKα/β,IkBa和p65的磷酸化。應用IMD-0354能夠逆轉由血管緊張素Ⅱ誘導的IkBa蛋白水平的降低。
　　結論:
　　1.免疫蛋白酶體亞基LMP10及其胰蛋白酶活性在血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓視網膜病變模型鼠的視網膜和血清，以及高血壓視網膜病變患者的血清中表達增加。
　　2.LMP10缺乏能夠改善由血管緊張素Ⅱ誘導視網膜

18、形態(tài)學改變、血管通透性增加、炎癥反應加重及氧化應激的損傷。LMP10基因過表達能夠加重血管緊張素Ⅱ誘導的視網膜形態(tài)學改變、血管通透性增加、炎癥反應激活及氧化應激的損傷。
　　3.LMP10在高血壓視網膜病交分子機制中具有重要作用，應用LMP10特異性抑制劑可能成為治療高血壓視網膜病變的新靶點。
　　4.應用IKKα抑制劑IMD-0354能夠有效緩解由血管緊張素Ⅱ引起的中央視網膜增厚、血管通透性的增加、炎癥反應及氧化應激。IM