免疫蛋白酶體亞基LMP10在血管緊張素Ⅱ引起的視網(wǎng)膜病變中的作用及機(jī)制.pdf

1、高血壓視網(wǎng)膜病變主要通過影響視網(wǎng)膜血管病理變化引起視網(wǎng)膜病理生理改變，其主要臨床特征包括視網(wǎng)膜動脈變細(xì)反光增強(qiáng)、動靜脈比例減小、動靜脈交叉壓迫征、出血、棉絮斑、嚴(yán)重者出現(xiàn)視神經(jīng)視盤水腫及動脈硬化的各種并發(fā)癥。
　　泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是真核細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)之一，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄、抗原呈遞、細(xì)胞增殖與分化以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過程。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)由泛素、泛素活化酶、泛素連接酶、泛素蛋白連接酶、26S蛋白酶體和去

2、泛素化酶組成。泛素-蛋白酶體降解蛋白是一種級聯(lián)反應(yīng)過程。完成泛素化的蛋白質(zhì)最終被20S蛋白酶體所降解。免疫蛋白酶體是一種由標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶體衍生的高效的蛋白水解機(jī)制，在各類炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。20S免疫蛋白酶體包含三個(gè)β功能亞單位（也被稱為免疫蛋白酶體亞基），包括β1i（LMP2和PSMB9）表達(dá)半胱氨酸蛋白酶活性，β2i（LMP10，PSMB10或mecl-1）表達(dá)胰蛋白酶活性和β5i（LMP7或PSMB8）表達(dá)糜蛋白

3、酶活性，研究證明免疫蛋白酶體具有更廣泛的生物學(xué)功能。在血管緊張素Ⅱ或高鹽刺激引起的系統(tǒng)性高血壓病變模型中，LMP10和LMP7兩種免疫蛋白亞基在心臟組織中表達(dá)增加，高鹽誘導(dǎo)高血壓模型LMP10敲除對小鼠心臟重構(gòu)具有抑制作用。此外，視網(wǎng)膜病變組織中免疫蛋白酶體亞基的表達(dá)和活性也明顯增加。抑制免疫蛋白酶體的活性能夠改善疾病的發(fā)生。然而，LMP10在視網(wǎng)膜病變中的作用機(jī)制研究甚少，在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓視網(wǎng)膜病變模型中的作用尚不清楚。

4、r>　　本研究通過建立血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓視網(wǎng)膜病變模型，采用野生型、LMP10基因敲除以及LMP10基因過表達(dá)三種不同小鼠，觀察在基因敲除/過表達(dá)或應(yīng)用IKKβ抑制劑的作用下不同模型的視網(wǎng)膜病理生理變化，旨在闡述LMP10在高血壓視網(wǎng)膜病變中的作用機(jī)制，進(jìn)一步探索LMP10通過降解PTEN和IKBα降低炎癥相關(guān)通路反應(yīng)從而改善視網(wǎng)膜病變的病理生理過程。
　　目的:
　　1.建立血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓視網(wǎng)膜病變野生小鼠

5、模型，觀察小鼠視網(wǎng)膜及外周血清中蛋白酶體亞基LMP10及胰蛋白酶活性水平，在臨床高血壓視網(wǎng)膜病變患者外周血清中檢測LMP10水平，明確LMP10在高血壓視網(wǎng)膜病變患者及鼠模型中的表達(dá)變化。
　　2.應(yīng)用LMP10基因敲除鼠建立血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓視網(wǎng)膜病變模型，觀察野生/基因敲除鼠視網(wǎng)膜病理表型變化，探討LMP10對高血壓小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)、炎癥、血管通透性改變、氧化應(yīng)激的影響，從分子水平闡述LMP10在高血壓視網(wǎng)膜病變中的作用

6、機(jī)制。
　　3.應(yīng)用腺相關(guān)病毒構(gòu)建眼內(nèi)LMP10過表達(dá)小鼠，觀察該鼠模型在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)下視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)、血管通透性改變、炎癥及氧化應(yīng)激的病理改變，進(jìn)一步探討LMP10在高血壓視網(wǎng)膜病變中的分子機(jī)制
　　4.應(yīng)用IKKβ特異性抑制劑IMD-0354作用于LMP10過表達(dá)/GFP空白對照小鼠，觀察阻斷NF-κB相關(guān)炎癥通路后不同組小鼠的視網(wǎng)膜病變情況，闡述LMP10及IMD-0354對PTEN/AKT/IKK通路的作用機(jī)制，討

7、論降低LMP10或應(yīng)用IKK抑制劑能夠改善由血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓視網(wǎng)膜病變的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.高血壓視網(wǎng)膜病變小鼠模型建立:應(yīng)用血管緊張素Ⅱ(3000ng/kg/min)緩釋泵灌注C57BL/6野生型小鼠，LMP10基因敲除小鼠3周誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變。給小鼠眼玻璃體腔注射2型腺相關(guān)病毒rAAV2-GFP對照或rAAV2-LMP10過表達(dá)LMP10，腹腔內(nèi)注射IKK抑制劑IMD-0354預(yù)處理小鼠。
　　2

8、.臨床資料和血清收集。包括健康人、高血壓患者（不合并高血壓視網(wǎng)膜病變）和高血壓視網(wǎng)膜病變患者一般情況、病例資料、眼科檢查及眼底照相、血清標(biāo)本。使用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清標(biāo)本LMP10含量，蛋白酶體活性試劑盒檢測胰蛋白酶活性。
　　3.視網(wǎng)膜病理觀察:應(yīng)用眼底血管造影系統(tǒng)觀察小鼠視網(wǎng)膜血管整體情況;應(yīng)用石蠟切片HE染色法、免疫組織化學(xué)方法、冰凍切片免疫熒光技術(shù)觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)、血管通透性、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)。

9、>　　4.應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western-blot）檢測LMP10，PTEN，p-AKT，AKT,p-IKKα/β，IKKβ，p-IkBα，IkBα，p-p65和p65蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　1.在血管緊張素Ⅱ（3000ng/kg/min，3周）誘導(dǎo)下，小鼠收縮壓顯著性升高。免疫蛋白酶體亞基LMP10及其胰蛋白酶活性在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓視網(wǎng)膜病變模型鼠的視網(wǎng)膜和血清，以及高血壓視網(wǎng)膜病變患者的血清中表達(dá)增加。

10、
　　2.LMP10缺乏能夠改善由血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)改變、血管通透性增加、炎癥反應(yīng)加重及氧化應(yīng)激的損傷。(1)HE染色顯示血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的野生型小鼠視網(wǎng)膜較鹽水組厚度增加，LMP10基因敲除小鼠視網(wǎng)膜厚度較野生型小鼠減少，差異具有統(tǒng)計(jì)性意義。(2)視網(wǎng)膜血管造影顯示血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓野生型小鼠視網(wǎng)膜動脈血管變細(xì)，小動脈狹窄，可見熒光彌散及滲漏，提示視網(wǎng)膜血管損傷，通透性增加。在LMP10敲除的高血壓小鼠模型中，這

11、一病理改變減輕。凝集素B4(Isolectin B4)免疫熒光染色顯示血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的野生型小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，LMP10敲除減輕了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖現(xiàn)象。此外，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF的蛋白水平變化也與視網(wǎng)膜血管通透性增加相關(guān)，且水平變化趨勢具有一致性。(3)二氫乙錠（超氧化物陰離子熒光探針，DHE）染色顯示血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜ROS活性氧增加，提示氧化應(yīng)激反應(yīng)的激活，在LMP10敲除小鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激程度減輕。同時(shí)

12、視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激NOX1和NOX4亞基mRNA水平的檢測支持這一現(xiàn)象。(4)Iba1（小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性蛋白抗體）免疫組織化學(xué)染色顯示在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的野生型小鼠視網(wǎng)膜中，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞及巨噬細(xì)胞增加，炎癥相關(guān)因子IL-1和IL-6mRNA水平表達(dá)上調(diào)，LMP10敲除后，視網(wǎng)膜炎癥表達(dá)減少。
　　3.通過檢測PTEN/AKT/NF-κB信號通路蛋白，發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ引起野生型小鼠視網(wǎng)膜p-IKKα/βand p-p65蛋

13、白水平表達(dá)增加，LMP10敲除小鼠能夠部分逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。此外，血管緊張素Ⅱ引起的IkBa蛋白降低在LMP10敲除的小鼠中得到顯著逆轉(zhuǎn)。說明LMP10敲除減少了IKKα/β和IkBa的降解，進(jìn)一步抑制了NF-kB通路的激活。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ引起PTEN蛋白水平降低，AKT水平增高，而這一變化在LMP10敲除小鼠視網(wǎng)膜中得到逆轉(zhuǎn)。
　　4.眼內(nèi)LMP10過表達(dá)小鼠模型的建立。玻璃體腔注射2型腺相關(guān)病毒(rAAV2)LMP1

14、0/GFP兩周后冰凍切片顯示視網(wǎng)膜腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染良好，與rAAV2-GFP小鼠相比，rAAV2-LMP10小鼠視網(wǎng)膜LMP10蛋白含量升高1.8倍。
　　5.過表達(dá)LMP10能夠加重血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)改變、血管通透性增加、炎癥反應(yīng)激活及氧化應(yīng)激的損傷。在3周血管緊張素Ⅱ的誘導(dǎo)下，rAAV2-GFP小鼠中央視網(wǎng)膜厚度增加，視網(wǎng)膜血管通透性增加、管腔變窄、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，VEGF蛋白及mRNA水平增高，這些病理改變在rA

15、AV2-LMP10小鼠視網(wǎng)膜中表現(xiàn)更加明顯。同時(shí)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激及炎癥損傷，NOX1、NOX4、IL-1、IL-6mRNA表達(dá)增加，這些改變在rAAV2-LMP10小鼠視網(wǎng)膜中更加突出。
　　6.血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的rAAV2-GFP小鼠視網(wǎng)膜PTEN和IkBa蛋白表達(dá)減少，LMP10過表達(dá)使這兩種蛋白表達(dá)進(jìn)一步減少。同時(shí)LMP10的過表達(dá)使血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)增多的AKT，IKKα/β和p65磷酸化水平進(jìn)一步增加。

16、>　　7.腹腔注射IKKβ抑制劑IMD-0354能夠有效緩解由血管緊張素Ⅱ引起的中央視網(wǎng)膜厚度的增加，視網(wǎng)膜血管通透性的增加及VEGF mRNA及蛋白表達(dá)水平的提高。同時(shí)，IMD-0354的應(yīng)用能夠降低由血管緊張素Ⅱ引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制視網(wǎng)膜小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞的激活及減少NOX1、NOX4、IL-1、IL-6mRNA表達(dá)量。
　　8.蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)應(yīng)用IMD-0354不能影響PTEN水平及AKT磷酸化程度。在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)下

17、的rAAV2-LMP10或rAAV2-GFP小鼠視網(wǎng)膜組織中，IMD-0354能夠顯著抑制IKKα/β,IkBa和p65的磷酸化。應(yīng)用IMD-0354能夠逆轉(zhuǎn)由血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的IkBa蛋白水平的降低。
　　結(jié)論:
　　1.免疫蛋白酶體亞基LMP10及其胰蛋白酶活性在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓視網(wǎng)膜病變模型鼠的視網(wǎng)膜和血清，以及高血壓視網(wǎng)膜病變患者的血清中表達(dá)增加。
　　2.LMP10缺乏能夠改善由血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)視網(wǎng)膜

18、形態(tài)學(xué)改變、血管通透性增加、炎癥反應(yīng)加重及氧化應(yīng)激的損傷。LMP10基因過表達(dá)能夠加重血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)改變、血管通透性增加、炎癥反應(yīng)激活及氧化應(yīng)激的損傷。
　　3.LMP10在高血壓視網(wǎng)膜病交分子機(jī)制中具有重要作用，應(yīng)用LMP10特異性抑制劑可能成為治療高血壓視網(wǎng)膜病變的新靶點(diǎn)。
　　4.應(yīng)用IKKα抑制劑IMD-0354能夠有效緩解由血管緊張素Ⅱ引起的中央視網(wǎng)膜增厚、血管通透性的增加、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激。IM