免疫蛋白酶體亞基PSMB10參與血管緊張素Ⅱ誘導的小鼠心房顫動的機制研究.pdf

1、心房顫動（房顫）是常見的持續(xù)性的心律失常之一，心房顫動的發(fā)病率隨著年齡的增長而升高。房顫患者心房內(nèi)快速不規(guī)則的電活動導致心房收縮受損，增加心臟病的發(fā)病率及死亡率，更糟糕的是促進血栓形成及栓塞（如腦卒中）等并發(fā)癥的發(fā)生，據(jù)文獻報道，由房顫造成的栓塞高達15％。實驗動物模型和人體研究表明，包括腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)和炎癥在內(nèi)的幾種主要信號通路參與了房顫的發(fā)生。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS的主要效應激素，在調(diào)節(jié)炎癥反應、氧化應激和

2、纖維化方面發(fā)揮著重要作用，這也是房顫的常見病理改變。越來越多的證據(jù)表明，AngⅡ發(fā)揮這些作用主要通過AT1受體和NF-kB、TGF-β信號通路的激活。相反，RAS的抑制減少了NF-kB、TGF-β介導的炎癥和心房纖維化。
　　泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)在調(diào)節(jié)蛋白質質量控制和各種疾病中起著關鍵作用。26S蛋白水解復合物由20S蛋白酶體和19S調(diào)節(jié)亞基組成。20S核心在β-環(huán)內(nèi)部具有三個標準催化亞基，即β1(PSMB6)、β2(PS

3、MB7)和β5(PSMB5)。用干擾素-γ(IFN-γ)等細胞因子刺激會誘導β1i（PSMB9或LMP2）、β2i(PSMB10、MECL-1或LMP10)和β5i(PSMB8或LMP7)取代標準亞基形成新的20S免疫蛋白酶體。據(jù)報道，免疫蛋白酶體在控制免疫應答，氧化應激和維持細胞蛋白質穩(wěn)態(tài)方面起著重要的作用。此外，免疫蛋白酶體比標準蛋白酶體能更有效地調(diào)節(jié)特定的細胞內(nèi)信號傳導途徑，例如NF-kB信號傳導。最近的研究表明，包括AngⅡ、高

4、鹽、異丙腎上腺素或壓力超負荷在內(nèi)的多種高血壓刺激可顯著增加心臟中標準和免疫蛋白酶體亞基的表達以及相應的蛋白水解活性，敲除PSMB10可以降低DOCA/鹽處理的小鼠血壓和心臟纖維化。然而，關于免疫蛋白酶體亞基PSMB10在調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ誘導的房顫中的作用尚不完全清楚。
　　目的:
　　通過AngⅡ灌注小鼠房顫模型，檢測小鼠心房纖維化、炎癥、氧化應激、離子通道的改變，探索免疫蛋白酶體亞基PSMB10參與調(diào)節(jié)房顫發(fā)生的分子機制。

5、同時研究IKK抑制劑IMD0354對房顫的影響及其分子機制。
　　方法:
　　運用AngⅡ持續(xù)微量灌注野生型C57BL/6小鼠(WT)、PSMB10基因敲除(PSMB10KO)小鼠和9型腺相關病毒-PSMB10轉染（rAAV9-PSMB10）小鼠三周建立小鼠房顫模型，使用小鼠鼠尾套管血壓監(jiān)測血壓，電生理檢測儀測量小鼠誘發(fā)房顫發(fā)生率及持續(xù)時間，Masson染色檢測心房纖維化程度，H&E、Mac-2染色檢測心房炎性細胞浸潤，DH

6、E染色檢測心房氧化應激，實時定量PCR檢測膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ、IL-1、IL-6、NOX-2和NOX-4的mRNA表達量對應評估心房纖維化、炎癥、氧化應激水平，蛋白免疫印跡法檢測小鼠心房PSMB10、離子通道、縫隙鏈接蛋白表達量及纖維化、炎癥信號通路變化，ELSIA檢測房顫患者血清PSMB10濃度，檢測小鼠心房組織和血清以及房顫患者血清胰蛋白酶樣活性，來研究免疫蛋白酶體亞基PSMB10參與調(diào)節(jié)房顫發(fā)生的分子機制。
　　結果:<

7、br>　　1.經(jīng)過三周的AngⅡ灌注，相比于生理鹽水灌注組，心房中PSMB10蛋白及mRNA表達量明顯增高，PSMB10對應的胰蛋白酶樣活性增強。
　　2.與對照組相比，房顫患者血清中PSMB10的濃度及胰蛋白酶樣活性也顯著增加。
　　3.相比于生理鹽水灌注，AngⅡ灌注野生型小鼠組房顫發(fā)生率及房顫持續(xù)時間顯著增加，而AngⅡ處理的PSMB10基因敲除小鼠組發(fā)生率及房顫持續(xù)時間均減少。
　　4.相比于生理鹽水灌注，An

8、gⅡ灌注野生型小鼠組心房纖維化水平、膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ表達明顯增加，PSMB10基因敲除小鼠組的纖維化改變均較AngⅡ灌注的野生型小鼠組減輕。
　　5.AngⅡ灌注可以減少小鼠心房中PTEN的表達，進而引起AKT1/TGF-β信號通路的激活，AngⅡ處理的PSMB10基因敲除小鼠組PTEN降解減少，AKT1/TGF-β信號通路的激活被抑制。
　　6.相比于生理鹽水灌注，AngⅡ灌注野生型小鼠組心房炎癥、氧化應激水平明顯增

9、加，PSMB10基因敲除小鼠組的上述病理改變均較AngⅡ灌注的野生型小鼠組減輕。
　　7.AngⅡ灌注引起小鼠心房縫隙鏈接蛋白43的蛋白表達水平增加，敲除PSMB10可以減少縫隙鏈接蛋白43的表達。
　　8.AngⅡ灌注可以促進小鼠心房中IKKβ的激活和IkBα的泛素化降解，導致NF-kB信號通路的激活，AngⅡ處理的PSMB10基因敲除小鼠組IkBα降解減少，NF-kB信號通路的激活被抑制。
　　9.相比于生理鹽水灌

10、注組，AngⅡ灌注rAAV9-GFP轉染小鼠組房顫發(fā)生率及房顫持續(xù)時間顯著增加，而AngⅡ處理的rAAV9-PSMB10轉染小鼠組房顫發(fā)生率及持續(xù)時間均進一步增加。
　　10.相比于AngⅡ處理的rAAV9-GFP或rAAV9-PSMB10轉染小鼠組，IMD0354（IKKβ抑制劑）減少房顫持續(xù)時間。
　　11.相比于生理鹽水灌注，AngⅡ灌注rAAV9-GFP轉染小鼠組心房纖維化明顯增加，AngⅡ處理的rAAV9-P SM

11、B10轉染小鼠組的纖維化進一步增加。AngⅡ灌注可以顯著引起rAAV9-GFP轉染小鼠心房中PTEN的減少，進而引起AKT1-TGF-β-Smad2/3信號通路的激活，AngⅡ處理的rAAV9-PSMB10轉染小鼠組PTEN的降解和AKT1-TGF-β-Smad2/3信號通路的激活進一步增加。
　　12.相比于AngⅡ處理的rAAV9-GFP或rAAV9-PSMB10轉染小鼠組，IMD0354對心房纖維化水平以及AKT1-TGF-

12、β-Smad2/3信號通路沒有影響。
　　13.相比于生理鹽水灌注組，AngⅡ灌注rAAV9-GFP轉染小鼠組炎癥、氧化應激、IL-1β、IL-6、NOX2和NOX4mRNA表達明顯增加，AngⅡ處理的rAAV9-P SMB10轉染小鼠組的上述改變進一步加重。AngⅡ灌注可以促進rAAV9-GFP轉染小鼠心房中NKKβ的激活和IkBα的泛素化降解，導致NF-kB信號通路的激活，過表達PSMB10使IkBα降解以及NF-kB信號通路

13、的激活進一步增強。
　　14.相比于AngⅡ處理的rAAV9-GFP或rAAV9-PSMB10轉染小鼠組，IMD0354降低心房炎性細胞浸潤、IL-1β和IL-6mRNA表達，同時降低NF-kB信號通路的激活。
　　15.AngⅡ灌注引起rAAV9-GFP轉染小鼠心房縫隙鏈接蛋白43的蛋白表達增加，過表達PSMB10可以增強縫隙鏈接蛋白43的表達。IMD0354降低心房縫隙鏈接蛋白43的表達。
　　結論:
　　A

14、ngⅡ灌注小鼠房顫模型中，小鼠房顫發(fā)生率及房顫持續(xù)時間明顯增多，心房組織纖維化、炎癥、氧化應激水平明顯增加，同時縫隙鏈接蛋白43的蛋白表達量上調(diào)。敲除PSMB10可以減輕上述現(xiàn)象。機制上，AngⅡ灌注引起PSMB10表達增多，促進PTEN的降解以及AKT1的激活，不僅促進TGF-β-Smad2/3信號通路的激活導致纖維化，同時還激活IKKβ和促進IkBα的泛素化降解，導致NF-kB目的基因（IL-1β、IL-6、NOX2、NOX4和CX

15、43）上調(diào)。在第二部分中，AngⅡ灌注rAAV9-GFP轉染小鼠房顫模型中，小鼠房顫發(fā)生率及房顫持續(xù)時間明顯增多，心房組織纖維化、炎癥、氧化應激水平明顯增加，同時縫隙鏈接蛋白43的蛋白表達量上調(diào)。過表達PSMB10可以進一步加重上述現(xiàn)象。另外，IMD0354能夠減少心房炎癥和氧化應激，但不影響心房纖維化。綜上所述，PSMB10在房顫發(fā)生中起到重要作用，IMD0453能夠降低房顫、心房炎癥和氧化應激，提示PSMB10可能是調(diào)節(jié)AngⅡ引發(fā)