免疫蛋白酶體亞基PSMB10參與血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心房顫動(dòng)的機(jī)制研究.pdf

1、心房顫動(dòng)（房顫）是常見的持續(xù)性的心律失常之一，心房顫動(dòng)的發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而升高。房顫患者心房?jī)?nèi)快速不規(guī)則的電活動(dòng)導(dǎo)致心房收縮受損，增加心臟病的發(fā)病率及死亡率，更糟糕的是促進(jìn)血栓形成及栓塞（如腦卒中）等并發(fā)癥的發(fā)生，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，由房顫造成的栓塞高達(dá)15％。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和人體研究表明，包括腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)和炎癥在內(nèi)的幾種主要信號(hào)通路參與了房顫的發(fā)生。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS的主要效應(yīng)激素，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和

2、纖維化方面發(fā)揮著重要作用，這也是房顫的常見病理改變。越來越多的證據(jù)表明，AngⅡ發(fā)揮這些作用主要通過AT1受體和NF-kB、TGF-β信號(hào)通路的激活。相反，RAS的抑制減少了NF-kB、TGF-β介導(dǎo)的炎癥和心房纖維化。
　　泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制和各種疾病中起著關(guān)鍵作用。26S蛋白水解復(fù)合物由20S蛋白酶體和19S調(diào)節(jié)亞基組成。20S核心在β-環(huán)內(nèi)部具有三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)催化亞基，即β1(PSMB6)、β2(PS

3、MB7)和β5(PSMB5)。用干擾素-γ(IFN-γ)等細(xì)胞因子刺激會(huì)誘導(dǎo)β1i（PSMB9或LMP2）、β2i(PSMB10、MECL-1或LMP10)和β5i(PSMB8或LMP7)取代標(biāo)準(zhǔn)亞基形成新的20S免疫蛋白酶體。據(jù)報(bào)道，免疫蛋白酶體在控制免疫應(yīng)答，氧化應(yīng)激和維持細(xì)胞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面起著重要的作用。此外，免疫蛋白酶體比標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶體能更有效地調(diào)節(jié)特定的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，例如NF-kB信號(hào)傳導(dǎo)。最近的研究表明，包括AngⅡ、高

4、鹽、異丙腎上腺素或壓力超負(fù)荷在內(nèi)的多種高血壓刺激可顯著增加心臟中標(biāo)準(zhǔn)和免疫蛋白酶體亞基的表達(dá)以及相應(yīng)的蛋白水解活性，敲除PSMB10可以降低DOCA/鹽處理的小鼠血壓和心臟纖維化。然而，關(guān)于免疫蛋白酶體亞基PSMB10在調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的房顫中的作用尚不完全清楚。
　　目的:
　　通過AngⅡ灌注小鼠房顫模型，檢測(cè)小鼠心房纖維化、炎癥、氧化應(yīng)激、離子通道的改變，探索免疫蛋白酶體亞基PSMB10參與調(diào)節(jié)房顫發(fā)生的分子機(jī)制。

5、同時(shí)研究IKK抑制劑IMD0354對(duì)房顫的影響及其分子機(jī)制。
　　方法:
　　運(yùn)用AngⅡ持續(xù)微量灌注野生型C57BL/6小鼠(WT)、PSMB10基因敲除(PSMB10KO)小鼠和9型腺相關(guān)病毒-PSMB10轉(zhuǎn)染（rAAV9-PSMB10）小鼠三周建立小鼠房顫模型，使用小鼠鼠尾套管血壓監(jiān)測(cè)血壓，電生理檢測(cè)儀測(cè)量小鼠誘發(fā)房顫發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間，Masson染色檢測(cè)心房纖維化程度，H&E、Mac-2染色檢測(cè)心房炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，DH

6、E染色檢測(cè)心房氧化應(yīng)激，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ、IL-1、IL-6、NOX-2和NOX-4的mRNA表達(dá)量對(duì)應(yīng)評(píng)估心房纖維化、炎癥、氧化應(yīng)激水平，蛋白免疫印跡法檢測(cè)小鼠心房PSMB10、離子通道、縫隙鏈接蛋白表達(dá)量及纖維化、炎癥信號(hào)通路變化，ELSIA檢測(cè)房顫患者血清PSMB10濃度，檢測(cè)小鼠心房組織和血清以及房顫患者血清胰蛋白酶樣活性，來研究免疫蛋白酶體亞基PSMB10參與調(diào)節(jié)房顫發(fā)生的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:<

7、br>　　1.經(jīng)過三周的AngⅡ灌注，相比于生理鹽水灌注組，心房中PSMB10蛋白及mRNA表達(dá)量明顯增高，PSMB10對(duì)應(yīng)的胰蛋白酶樣活性增強(qiáng)。
　　2.與對(duì)照組相比，房顫患者血清中PSMB10的濃度及胰蛋白酶樣活性也顯著增加。
　　3.相比于生理鹽水灌注，AngⅡ灌注野生型小鼠組房顫發(fā)生率及房顫持續(xù)時(shí)間顯著增加，而AngⅡ處理的PSMB10基因敲除小鼠組發(fā)生率及房顫持續(xù)時(shí)間均減少。
　　4.相比于生理鹽水灌注，An

8、gⅡ灌注野生型小鼠組心房纖維化水平、膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ表達(dá)明顯增加，PSMB10基因敲除小鼠組的纖維化改變均較AngⅡ灌注的野生型小鼠組減輕。
　　5.AngⅡ灌注可以減少小鼠心房中PTEN的表達(dá)，進(jìn)而引起AKT1/TGF-β信號(hào)通路的激活，AngⅡ處理的PSMB10基因敲除小鼠組PTEN降解減少，AKT1/TGF-β信號(hào)通路的激活被抑制。
　　6.相比于生理鹽水灌注，AngⅡ灌注野生型小鼠組心房炎癥、氧化應(yīng)激水平明顯增

9、加，PSMB10基因敲除小鼠組的上述病理改變均較AngⅡ灌注的野生型小鼠組減輕。
　　7.AngⅡ灌注引起小鼠心房縫隙鏈接蛋白43的蛋白表達(dá)水平增加，敲除PSMB10可以減少縫隙鏈接蛋白43的表達(dá)。
　　8.AngⅡ灌注可以促進(jìn)小鼠心房中IKKβ的激活和IkBα的泛素化降解，導(dǎo)致NF-kB信號(hào)通路的激活，AngⅡ處理的PSMB10基因敲除小鼠組IkBα降解減少，NF-kB信號(hào)通路的激活被抑制。
　　9.相比于生理鹽水灌

10、注組，AngⅡ灌注rAAV9-GFP轉(zhuǎn)染小鼠組房顫發(fā)生率及房顫持續(xù)時(shí)間顯著增加，而AngⅡ處理的rAAV9-PSMB10轉(zhuǎn)染小鼠組房顫發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間均進(jìn)一步增加。
　　10.相比于AngⅡ處理的rAAV9-GFP或rAAV9-PSMB10轉(zhuǎn)染小鼠組，IMD0354（IKKβ抑制劑）減少房顫持續(xù)時(shí)間。
　　11.相比于生理鹽水灌注，AngⅡ灌注rAAV9-GFP轉(zhuǎn)染小鼠組心房纖維化明顯增加，AngⅡ處理的rAAV9-P SM

11、B10轉(zhuǎn)染小鼠組的纖維化進(jìn)一步增加。AngⅡ灌注可以顯著引起rAAV9-GFP轉(zhuǎn)染小鼠心房中PTEN的減少，進(jìn)而引起AKT1-TGF-β-Smad2/3信號(hào)通路的激活，AngⅡ處理的rAAV9-PSMB10轉(zhuǎn)染小鼠組PTEN的降解和AKT1-TGF-β-Smad2/3信號(hào)通路的激活進(jìn)一步增加。
　　12.相比于AngⅡ處理的rAAV9-GFP或rAAV9-PSMB10轉(zhuǎn)染小鼠組，IMD0354對(duì)心房纖維化水平以及AKT1-TGF-

12、β-Smad2/3信號(hào)通路沒有影響。
　　13.相比于生理鹽水灌注組，AngⅡ灌注rAAV9-GFP轉(zhuǎn)染小鼠組炎癥、氧化應(yīng)激、IL-1β、IL-6、NOX2和NOX4mRNA表達(dá)明顯增加，AngⅡ處理的rAAV9-P SMB10轉(zhuǎn)染小鼠組的上述改變進(jìn)一步加重。AngⅡ灌注可以促進(jìn)rAAV9-GFP轉(zhuǎn)染小鼠心房中NKKβ的激活和IkBα的泛素化降解，導(dǎo)致NF-kB信號(hào)通路的激活，過表達(dá)PSMB10使IkBα降解以及NF-kB信號(hào)通路

13、的激活進(jìn)一步增強(qiáng)。
　　14.相比于AngⅡ處理的rAAV9-GFP或rAAV9-PSMB10轉(zhuǎn)染小鼠組，IMD0354降低心房炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、IL-1β和IL-6mRNA表達(dá)，同時(shí)降低NF-kB信號(hào)通路的激活。
　　15.AngⅡ灌注引起rAAV9-GFP轉(zhuǎn)染小鼠心房縫隙鏈接蛋白43的蛋白表達(dá)增加，過表達(dá)PSMB10可以增強(qiáng)縫隙鏈接蛋白43的表達(dá)。IMD0354降低心房縫隙鏈接蛋白43的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　A

14、ngⅡ灌注小鼠房顫模型中，小鼠房顫發(fā)生率及房顫持續(xù)時(shí)間明顯增多，心房組織纖維化、炎癥、氧化應(yīng)激水平明顯增加，同時(shí)縫隙鏈接蛋白43的蛋白表達(dá)量上調(diào)。敲除PSMB10可以減輕上述現(xiàn)象。機(jī)制上，AngⅡ灌注引起PSMB10表達(dá)增多，促進(jìn)PTEN的降解以及AKT1的激活，不僅促進(jìn)TGF-β-Smad2/3信號(hào)通路的激活導(dǎo)致纖維化，同時(shí)還激活I(lǐng)KKβ和促進(jìn)IkBα的泛素化降解，導(dǎo)致NF-kB目的基因（IL-1β、IL-6、NOX2、NOX4和CX

15、43）上調(diào)。在第二部分中，AngⅡ灌注rAAV9-GFP轉(zhuǎn)染小鼠房顫模型中，小鼠房顫發(fā)生率及房顫持續(xù)時(shí)間明顯增多，心房組織纖維化、炎癥、氧化應(yīng)激水平明顯增加，同時(shí)縫隙鏈接蛋白43的蛋白表達(dá)量上調(diào)。過表達(dá)PSMB10可以進(jìn)一步加重上述現(xiàn)象。另外，IMD0354能夠減少心房炎癥和氧化應(yīng)激，但不影響心房纖維化。綜上所述，PSMB10在房顫發(fā)生中起到重要作用，IMD0453能夠降低房顫、心房炎癥和氧化應(yīng)激，提示PSMB10可能是調(diào)節(jié)AngⅡ引發(fā)