氯氮平的法醫(yī)毒物動力學研究.pdf

1、目的:
　　 1．建立生物檢材中氯氮平的氣相色譜和氣相色譜/質(zhì)譜檢測方法；
　　 2．建立氯氮平的毒物動力學、動態(tài)分布、死后分布、死后再分布、死后彌散、分解動力學動物模型；
　　 3．研究氯氮平在實驗動物體內(nèi)的毒物動力學、動態(tài)分布、死后分布、死后再分布、分解動力學規(guī)律，為氯氮平中毒（死）案件的法醫(yī)學鑒定提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1．樣品的處理和氣相色譜、氣相色譜/質(zhì)譜檢測：血、組織樣品中

2、加入內(nèi)標物SKF525A，經(jīng)0.5moL/L NaOH溶液調(diào)Ph=10，乙醚萃取，薄層色譜掃描、氣相色譜、氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法定性，定量檢測氯氮平含量。
　　 2．毒物動力學：雄性家兔6只，隨即分為兩組，分別用1/2LD50(135 mg/kg)與LD50(270mg/kg)劑量灌胃，于灌胃后1、1.5、2、3、5、7、9、13 h 頸動脈取血1mL。GC/MS和GC 定性、定量檢測其中氯氮平含量。采用winNonlin藥代動力

3、學軟件處理平均藥物濃度時間數(shù)據(jù)，根據(jù)AIC信息判據(jù)選擇模型，計算毒物動力學參數(shù)。
　　 3．動態(tài)分布：雄性wistar大鼠27只，經(jīng)灌胃勻速注入1/4LD50(65mg/kg)氯氮平，分別于給藥后1、2、3、3.5、4、4.5、5、6、8h 處死大鼠，取心血、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦。心血加入肝素抗凝，4℃冰箱保存，其余臟器冷凍保存，樣品經(jīng)提取后進行薄層色譜檢測。
　　 4．死后分布：家兔6只，隨機分為兩組，分別

4、LD50(270mg/kg)、4LD50(1080mg/kg)灌胃，死亡當時，迅速解剖動物，取心血、心、肝、脾、肺、腎、腦等冷凍保存，堿性乙醚提取，GC/MS和GC 定性定量檢測其中氯氮平含量。
　　 5．死后再分布：Wistar大鼠，162只，雄性，隨機分為3組，隨機選擇2組1/2 LD50(130mg/kg)氯氮平灌胃，另一組治療量灌胃，2h 達峰時立即處死。1/2 LD50灌胃的2組中隨機抽取一組去胃后，置于室溫(20?C

5、)條件下，于死后0、2、4、8、12、24、48、72、96h 取心血-20?C 保存待檢。家兔，48只，雄性，體重2000±500g，隨機分為兩組，其中一組結(jié)扎門靜脈，分別LD50(270mg/kg)灌胃，2h 達峰時立即處死，仰臥位置于室溫(20?C)條件下，于死后0、2、4、8、12、24、48、72h 各組分別取3只家兔心血，-20℃冰箱保存待檢。解凍，液-液萃取血液，GC/MS和GC 法定性、定量檢測氯氮平含量。
　　

6、 6．死后彌散：雄性家兔33只，隨機分為死后彌散組（15只）、溫度影響組（6只）、劑量影響組（6只）、灌胃時間影響組（6只）。死后彌散組：將家兔固定于兔臺上，插胃管后，夾閉氣管處死；死后1h后，LD50(270mg/kg)氯氮平灌胃染毒，將染毒后家兔置于常溫環(huán)境下，分別于0.5d、1d、2d、4d、6d 各解剖3只家兔，取心、肝、脾、肺、腎、腦、左下肢肌、右下肢肌、心血、周圍血、玻璃體液、尿、膽汁，置于-20℃冰箱內(nèi)保存待檢。溫度影響組

7、：將家兔固定于兔臺上，插胃管后，夾閉氣管處死；死后1h后，LD50(270mg/kg)氯氮平灌胃染毒，將染毒后家兔（各3只）分別置于-20℃、4℃和常溫環(huán)境下，4d解剖動物，取心、肝、脾、肺、腎、腦、左下肢肌、右下肢肌、心血、周圍血、玻璃體液、尿、膽汁，置于-20℃冰箱內(nèi)保存待檢。劑量影響組：將家兔固定于兔臺上，插胃管后，夾閉氣管處死；死后1h后，1/2 LD50與2 LD50氯氮平灌胃染毒，將染毒后家兔置于常溫環(huán)境下，4d 解剖動物，

8、取心、肝、脾、肺、腎、腦、左下肢肌、右下肢肌、心血、周圍血、玻璃體液、尿、膽汁，置于-20℃冰箱內(nèi)保存待檢。灌胃時間影響組：將家兔固定于兔臺上，插胃管后，夾閉氣管處死；分別于死后3h和6h 以LD50(270mg/kg)氯氮平灌胃染毒，將染毒后家兔置于常溫環(huán)境下，4d 解剖動物，取心、肝、脾、肺、腎、腦、左下肢肌、右下肢肌、心血、周圍血、玻璃體液、尿、膽汁，置于-20℃冰箱內(nèi)保存待檢。
　　 7．保存檢材中分解動力學：雄性犬6只

9、，4LD50劑量(0.605g/kg)灌胃。灌胃后2h，經(jīng)股動脈插管采血，肝素抗凝；放血處死，取肝臟。每只犬血分四等份分別置于20℃、4℃、-20℃、20℃(加NaF 至1％)，每只犬肝分四等份分別置于20℃、4℃、-20℃、20℃（4％甲醛），分別于0、1、7、14、21、35、49、133d 取材提取，GC/MS和GC 法定性、定量檢測其中氯氮平含量。采用WinNonlin 藥代動力學軟件處理平均藥物濃度，擬合分解動力學方程，計算分

10、解半衰期。
　　 8．用SPSS 13.0通用統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均用x±s表示，采用方差分析，LSD 檢驗。
　　 結(jié)果:
　　 1.氣相色譜/質(zhì)譜檢測：氣相色譜/質(zhì)譜分析氯氮平的特征離子為243，256。氣相色譜檢測，心血中氯氮平氣相色譜檢測的回歸方程Y=33.396X+0.9248(μg/Ml)、線性檢測范圍(0.1-48)μg/Ml、相關(guān)系數(shù)0.985、回收率(92.40±1.

11、0)％、最低檢出濃度0.1μg/Ml。
　　 2．氯氮平在家兔體內(nèi)的藥（毒）物代謝動力學過程呈一級動力學特征，符合一室開放模型。1/2 LD50劑量氯氮平的藥（毒）代動力學方程、平均吸收半衰期和平均消除半衰期為Ct=3.397028（e-2.57018t-e-0.27963t）、0.694433h和2.484292h。LD50劑量氯氮平的藥（毒）代動力學方程、平均吸收半衰期和平均消除半衰期為為Ct=2.256018(e-2.98

12、751t-e-0.33022t）、1.529528h和3.798686h。
　　 3.1/4LD50劑量氯氮平在大鼠體內(nèi)的動態(tài)分布符合口服給藥一級動力學一室開放模型過程，各臟器中氯氮平的動態(tài)分布也符合血管外給藥一級動力學開放一室模型。心血中達峰時間和消除半衰期除為1.87h和4.91h；各臟器中達峰時間和消除半衰期為2.37～2.99 h和1.27～12.57h。在各組織臟器中的分布情況為心血、心、肝、腦氯氮平含量高，脾、肺、腎

13、中氯氮平含量隨時間先升高后降低。
　　 4．死后分布：死亡當時家兔各臟器組織氯氮平含量由高到低分別為(t 檢驗，P<0.05)：①LD50組：肺（108.63±39.55）>肝（46.38±9.59）、腦（44.79±38.57）、脾（24.56±3.74）、 腎（24.14±2.39）>膽汁（9.85±1.96）、心（9.70±4.40）、心血（5.95±0.72） 、尿（5.02±0.57）、 玻璃體液（4.92±0.55）

14、>下肢?。?.00±1.28）；②4LD50組：肺（273.16±131.24）、肝（269.03±120.75）>腦（178.81±144.44）、脾（103.02±23.48）、 腎（96.19±67.38）>膽汁（36.53±25.92）、心（24.48±8.84）、下肢?。?1.57±7.89）、 心血（10.26±2.91）、玻璃體液（7.85±4.84）>尿（5.35±0.88）。
　　 5．死后再分布：染毒大鼠1/

15、2 LD50去胃組在處死后24h 氯氮平濃度顯著升高(P<0.05)，此時心血濃度與死亡當時心血濃度之比（C24h/C0h）達4.32；1/2 LD50非去胃組在處死后8-24h氯氮平濃度顯著升高(P<0.05)，此時心血濃度與死亡當時心血濃度之比（C8-24h/C0h）達1.69-3.06；治療量組在處死后2-48h 氯氮平濃度顯著升高(P<0.05)，此時心血濃度與死亡當時心血濃度之比（C8-24h/C0h）達1.86-3.15。染

16、毒家兔結(jié)扎門靜脈組在處死后4-48h 氯氮平濃度發(fā)生降低（P<0.05），此時心血濃度與死亡當時心血濃度之比（C4-48h/C0h）達0.69-0.78。6．死后彌散：家兔處死后1小時LD50氯氮平灌胃染毒，室溫下心、肝、肺、腎、左下肢、右下肢、心血在12h 可以檢測出氯氮平，腦，膽汁在2d 開始檢出氯氮平；尿中始終未檢出氯氮平。常溫、4 度、-20度條件下左下肢肌、右下肢肌、尿、玻璃體液均未檢出氯氮平，-20度時心血、外周血、膽汁、心

17、、腎、腦均未檢出氯氮平，肝臟中氯氮平的濃度隨著保存溫度的降低而降低，且具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。1/2 LD50、LD50、2LD50三種劑量下右下肢肌、尿、膽汁中未檢出氯氮平，隨著給藥劑量增大，心、右下肢肌、玻璃體液中氯氮平濃度增大（P<0.05）。在死后1h、3h、6h 三種灌胃時間條件下，左下肢肌、右下肢肌、尿、玻璃體液中均未檢出氯氮平，在死后6h 灌藥，心、腎、膽汁中未檢出氯氮平。
　　 7．分解動力學：不同條件保

18、存血和肝中氯氮平含量均呈下降趨勢，氯氮平在血和肝中的分解動力學呈一級動力學特征，符合一室開放模型。20℃、4℃、-20℃、20℃（加NaF至1％）保存至7d、21d、35d、49d，犬血中氯氮平濃度分別顯著下降至最初濃度的28.93％、16.11％、14.06％、0.11％；78.48％、55.14％、53.44％、34.02％；66.27％、38.85％、31.04％、17.70％；91.49％、88.49％、74.07％、68.90

19、％。保存133 d時犬血中氯氮平濃度分別顯者下降至最初濃度的0.10％、12.14％、19.28％、62.20％，其分解半衰期分別為：8.31d、19.90d、35.49d、171.16d。20℃、4℃、-20℃、20℃（10％甲醛）保存至7d、21d、35d、49d時犬肝中氯氮平濃度分別顯者下降至最初濃度的62.93％、59.88％、50.69％、45.83％；70.73％、75.39％、45.96％、44.67％；77.27％、74

20、.72％、67.97％、58.59％；28.78％、27.95％、23.03％、13.98％。保存133 d時犬肝中氯氮平濃度分別顯者下降至最初濃度的43.51％、41.27％、50.19％、 10.90％，其分解半衰期分別為：79.40d、82.35d、100.89d、8.88d。
　　 結(jié)論:
　　 1．本文建立了生物檢材中氯氮平氣相色譜/質(zhì)譜檢測方法，選擇性好，定性準確，氣相色譜檢測簡便，快速，靈敏，定量結(jié)果準確，

21、可應用于氯氮平中毒的臨床快速檢驗診斷和中毒（死）案件的法醫(yī)學鑒定；建立了氯氮平的毒物動力學、死后分布、死后再分布、死后彌散、分解動力學研究動物模型，可應用于氯氮平的法醫(yī)毒物動力學研究。
　　 2．氯氮平在家兔體內(nèi)的毒物動力學呈一級動力學過程，符合一室開放模型。染毒劑量增大，其吸收半衰期和消除半衰期均延長大，染毒劑量對氯氮平的代謝動力學有影響。
　　 3．氯氮平在大鼠體內(nèi)動態(tài)分布符合口服給藥一級動力學一室開放模型，各臟器與

22、血液的C-T曲線大致相似，臟器濃度與血液濃度具有一致的動態(tài)變化，吸收半衰期無顯著性差異；但是心血、心臟、肝臟與其他臟器的消除半衰期具有顯著性差異。說明氯氮平進入體內(nèi)后，能迅速向各組織器官分布，并達到動態(tài)平衡。
　　 4．4LD50劑量染毒家兔體內(nèi)氯氮平含量以肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦居多；LD50劑量染毒家兔體內(nèi)氯氮平以肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦居多，由此可見不同劑量對氯氮平的死后分布沒有影響。
　　 5．死后再分布：染

23、毒大鼠1/2 LD50非去胃組8-24h發(fā)生死后再分布，而1/2 LD50去胃組在24h發(fā)生死后再分布，后者發(fā)生死后再分布的時間延遲原因可能為摘除胃，使得藥物蓄積庫不存在引起的；治療量組在2-48h發(fā)生死后再分布；說明劑量對死后再分布有影響。門靜脈結(jié)扎家兔組心血中氯氮平濃度降低，原因可能為門靜脈被結(jié)扎，阻止了死后血液流動。綜上可見，去胃和門靜脈結(jié)扎均影響到死后再分布，說明了蓄積庫順濃度梯度擴散是與死后血液流動是發(fā)生死后再分布的機制。同時

24、門靜脈結(jié)扎也驗證了死后血液流動的存在。
　　 6．死后彌散：脾、肺、心、肝、腎受死后彌散影響較大，左下肢肌、右下肢肌、玻璃體液、心血、外周血、腦，膽汁受到死后彌散的影響較小，尿液中無影響。溫度、灌胃時間對氯氮平死后彌散有影響，灌藥劑量對死后彌散影響較小。氯氮平在各臟器中死后彌散不均勻，這可能與藥物本身的性質(zhì)、臟器的血流量、漿蛋白結(jié)合率以及與胃的距離遠近等許多影響因素有關(guān)。
　　 7．在20℃、4℃、-20℃、20℃（加N

25、aF至1％）保存條件下，血中氯氮平均呈現(xiàn)下降趨勢，可見在NaF添加組中血中氯氮平的降解最慢（P<0.05），其次隨著溫度降低氯氮平的降解明顯減慢；在20℃、4℃、-20℃、20℃（10％甲醛）保存條件下，肝臟中氯氮平均呈現(xiàn)下降趨勢，其分解半衰期分別為：79.40d、82.35d、100.89d、8.88d，可見在甲醛添加組中肝臟中氯氮平的降解最快（P<0.05），其次隨著溫度降低氯氮平的降解明顯減慢。說明溫度可以影響保存檢材中氯氮平的降